Pentru a studia rolul oxidului nitric în dezvoltarea rezistenței la insulină

DISERTATURA UNIVERSITARĂ (dr.) Studierea rolului oxidului nitric în dezvoltarea rezistenței la insulină Ágnes Bajza Supervizor: Dr. Zoltán Szilvássy, doctor al Academiei Maghiare de Științe UNIVERSITATEA DEBRECEN ȘCOALA DOCTORALĂ DE ȘTIINȚE FARMACEUTICE 2013 Debrec

CUPRINS 1. Abrevieri 4. 2. Introducere 6. 2.1. Rezistența la insulină 7. Receptorul insulinei 7. Acțiunea insulinei și transducția semnalului 8. Determinarea insulinei 10. 10 . Nitrați 13. Mecanismul de acțiune al nitraților 14 Mecanisme de toleranță la nitrați 15. Toleranță la nitrați și mecanisme cardioprotectoare 17. 2.3. Colecistochinina 18. Activitatea și semnalizarea CCK 19. 3. Obiective 21. 4. Materiale și metode 23. 4.1. Comparația efectelor tratamentului acut și subcronic (7 zile) cu nitroglicerină și investigarea dezvoltării rezistenței la insulină la iepuri treji 23. Intervenție chirurgicală 23. Utilizarea intravenoasă a glucozei 24. Clemă hiperinsulinemică de glucoză euglicemică (HEGC) 24. Toleranță la azotat hemodinamic 24. Inducerea azotatului hemodinamic Analiza statistică 26. 4.2. Investigația efectului toleranței la nitrați și a potențialului rol al CCK asupra fenomenului de sensibilizare la insulină indusă de alimente la iepuri 26. Descrierea experimentului 26. Verificarea toleranței la nitrați 28. RIST (Test rapid de sensibilitate la insulină) 28. HEGC (hiperinsulinemic clemă euglicemică) 29. Măsurarea nivelurilor de cgmp hepatic 30. Analiza statistică 30. 2

5. Rezultate 31. 5.1. Comparația efectelor tratamentului acut și subcronic (7 zile) cu nitroglicerină și investigarea dezvoltării rezistenței la insulină la iepuri treji 31. Efectul toleranței hemodinamice la nitrați asupra elementelor de bază ale hemodinamicii și producției de metemoglobină 31. Efectul toleranței la nitrați asupra utilizării glucozei 32 Efectul toleranței la nitrați asupra sensibilității la insulină 32. Efectul nitroglicerinei transdermice asupra sensibilității la insulină în toleranța la nitrați sau lipsa acestora 33. 5.2. Investigarea efectului toleranței la nitrați și a rolului potențial al CCK asupra fenomenului de sensibilizare la insulină indusă de alimente la iepuri. 34. Toleranță hemodinamică a nitraților datorată NG transdermic 34. Modificarea indicelui RIST la animalele tolerante și netolerante la nitrat postite și re-alimentate 35. Sensibilitatea insulinei măsurată de HEGC la animalele tolerante și netolerante la nitrat postite și re-alimentate 36. Efectul de sensibilizare la insulină CCK8 în timpul stării de echilibru a HEGC 36. Efectul perfuziei CCK8 asupra cgmp hepatic la iepuri toleranți la nitrați 37. 6. Discuție 38. 7. Rezumat 44. 8. Rezumat 45. 9. Literatură 46. 10. Publicații proprii 55. 11. Cuvinte cheie 57. 12. Mulțumiri 58. 13. Anexa 59. 3

1. Abrevieri Akt (PKB) protein kinază-b PKC protein kinază-c CCK-1 (CCK-A) receptor colecistokinin-1 CCK-2 (CCK-B) receptor colecistokinin-2 CCK-4 colecistokinin tetrapeptid CCK-8 colecistokinin octapeptid Receptor CCK receptor colecistokinin cgmp ciclic guanozin monofosfat DAG diacilglicerol GC clemă euglicemică ELISA enzimă legată test imunitar enos oxid nitric endotelial sintază ET-1 endotelină-1 FOXO furcă de proteină de box (factor de transcripție) FSIGTTqu proteină (proteină legată de receptorul factorului de creștere) GSK3 glicogen sintază kinază 3 GTN gliceril trinitrat GTP guanozină monofosfat HEGC hiperinsulinemic clemă euglicemică HISS Frecvență cardiacă hepititică IDDM diabet zaharat insulinodependent IP 2 inozitol 1,4-bisfosfat IP 3 inozitol 1,4,5 -trisfosfat IRS receptor de insulină sub straturi iv. intravenos 4

IVGTT IVITT L-NAME MABP MAPK MEK NANC NG NIDDM NO NOS OGTT PDK PHA PI-3-kinase PIP2 PIP3 PL-C, PLC RAF RAS RIA RIST SD SH2, SH3 SH grup SIN-1 SOS SSPG test de toleranță la glucoză intravenoasă insulină intravenoasă NG -nitro-L-arginină metil ester presiune medie arterială mitogen activat protein kinază mitogen activat kinază kinază non-adrenergic non-colinergic nitroglicerină non-insulină dependentă de diabet zaharat oxid nitric oxid nitric sintază test de toleranță la glucoză orală fosfoinozitidă dependentă de protein kinază plexus hepatic anterior fosfatidil 3-kinază fosfatidilinozitol 4,5-bisfosfat fosfatidilinozitol 3,4,5-trisfosfat fosfolipază-c proto-oncogenă serină/treonină protein kinază GTP-legare grup SrTP domiciliu grup Sr.-morfolinosidononină guanină proteină de înlocuire a nucleotidelor (Fiul lui Sevenless) glucoza plasmatică 5

se leagă de proteine. Proteinele de legare (cunoscute și sub numele de proteine de andocare) au site-uri speciale de legare numite Acestea conțin situri de legare SH2, SH3 care permit legarea enzimelor (de exemplu, PI-3-kinază, PL-C, GAP etc.). Activarea acestor enzime este esențială pentru transmiterea semnalelor inițiate de insulină. Este important de reținut că proteina IRS este un punct foarte important în sistemul cascadei, deoarece este ramificată de căi din mai multe direcții (Gustafson și colab. 1999; Kellerer și colab. 1999). Sistemul de transport al glucozei este activat și glucoza curge în celulă. Ulterior, procesul se desfășoară fie în direcția stocării glucozei, fie spre oxidarea glucozei, în funcție de ceea ce are nevoie corpul în prezent (DeFronzo 1988, DeFronzo și colab. 1979). Figura 2. Structura generală a căii de semnalizare a insulinei. Ramura PI3K a semnalizării insulinei reglează metabolismul glucozei în mușchiul scheletic, țesutul adipos și ficatul, stimulând în același timp producția de NO și vasodilatația în endoteliul vascular. Ramura MAPK a căii de transducție a semnalului insulinei reglează în general mitogeneza și controlul secreției ET-1 în endoteliul vascular. (vezi abrevierile din lista abrevierilor). Sursa: Muniyappa R, Montagnani M, Koh KK și colab. Acțiunea cardiovasculară a insulinei. Endocr Rev 2007; 28: 463-491 9

(de exemplu, devazepid) și derivați de aminoacizi (de exemplu, proglumid) (Bock și colab. 1986; Chang și colab. 1986; Hahne și colab. 1981). 20

Pe baza acestor considerații, principalele obiective ale lucrării experimentale au fost: 1. compararea efectelor tratamentului cu nitroglicerină acută și subcronică (7 zile) și investigarea dezvoltării rezistenței la insulină la iepuri treji, 2. investigarea efectului azotatului toleranța și rolul potențial al CCK în sensibilizarea la insulină indusă de alimente la iepuri. 22

Figura 4. Reprezentarea schematică a studiului. PLAC: placebo, TDNG: nitroglicerină transdermică, NG: nitroglicerină acută (pentru explicații vezi text) Analiza statistică Datele au fost analizate de ANOVA urmate de un test t modificat conform Bonferroni. Rezultatele obținute au fost considerate semnificative dacă P