Dezvoltarea, testarea in vitro și in vivo a formulărilor orale și externe care conțin Silybum marianum
S KoA. a, R-COOH + ATP + CoA R C
DISERTATURA UNIVERSITARĂ (doctorat) Dezvoltarea, studiul in vitro și in vivo a formelor de dozare orale și externe care conțin Silybum marianum Dr. Siposné Dr. Fehér Pálma Supervizor: Dr. Miklós Vecsernyés UNIVERSITATEA DEBRECEN 2017 DOCTOR DE ȘTIINȚE FARMACEUTICE
7. Bibliografie. 94 7.1. Literatura folosită pentru pregătirea disertației. 94 7.2. Lista verificată a publicațiilor pe care se bazează disertația. 113 7.3. Lista figurilor. 117 7.4. Lista de mese. 120 8/A Cuvinte cheie. 121 8/B Cuvinte cheie. 121 9. Mulțumiri. 122 Anexa 10. 123 10.1. Ajutor. 123 10.2. Lucrări pe care se bazează disertația. 124 5
Abrevieri AAPS American Association of Pharmaceutical Scientists ALT alanin aminotransferază AST aspartat aminotransferază BCS Sistem de clasificare biofarmaceutică BHT hidroxitoluen butilat CAT catalază CCl4 Tetraclorură de carbon CLS Linii celulare Serviciu DLS Difuzare dinamică a luminii DMEM Dulbecco s Modificat Eagle s Medil Etilac Ser bovin FDA Food and Drug Administration GC/MS Cromatografie gazoasă - Spectroscopie de masă GPx Glutation peroxidază GR Glutation reductază GSH glutation GSSG Glutation disulfură HaCaT Temperatură L2a Piele adultă umană Keratinocite, echilibru redus de Ca HO Hemogen oxigenat HPLC-MS/MS Cromatografie lichidă de înaltă performanță -spectroscopie de masă tandem IL Interleukin IPM miropat de izopropil MDA Malondialdehidă MTT 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromură NADH Nicotinamidă adenină dinuc leotida 6
NADPH Nicotinamidă adenină dinucleotid fosfat NF-κB Factor nuclear kappa-amplificator de lanț ușor al celulelor B activate NMF Factor natural de hidratare Nrf2 Factor nuclear eritoid factor 2 legat 2 PBS fosfat tamponat salin PS 750 zaharoză palmitală ROS Reactiv oxigen Specii SD Deviație standard Sistem de livrare a medicamentelor emulsionante SLN Nanoparticule lipidice solide SMEDDS Sistem de livrare a medicamentelor auto-emulsionante SOD Superoxid dismutaza SP 50 Stearae de zaharoză 50% monoesteri SP 70 Stearat de zaharoză 70% monoesteri TBA Acid tiobarbituric TC Transcermol TNFα Factor tumoral Organizația lumii Statele Unite 7
Figura 2. Schița lucrării experimentale 11
2. Revizuirea literaturii 2.1. Silybum marianum Silybum marianum este planta cea mai frecvent utilizată pentru prevenirea și tratamentul bolilor hepatice (Figura 3) (Pepping 1999, Shaker și colab. 2010). Sunătoarea a fost folosită cu succes în medicina populară de secole. Planta aparține tribului culturilor închise și familia inflorescențelor cuibăritoare (Asteraceae), originară din Asia de Sud-Vest, este o plantă cultivată în Ungaria (Vargas-Mendoza și colab. 2014). Figura 3. Silybum marianum/sursa: http://evgyogynovenye.hu/2013_mariatovis/ 2.2. Compoziția chimică a semințelor de Silybum marianum Fructul maro al sunătoarei (Silybi mariani fructus) este utilizat în medicină. Este, de asemenea, oficial în Farmacopeea maghiară ca Silybi mariani extractum siccum rafinatum et normum. Preparatul este un extract purificat, standardizat al fructului, conținutul său de silimarină este de 30-65%, este materia primă a multor medicamente, produse medicamentoase și suplimente alimentare din Ungaria (Ph. Hg.VIII.). Randamentul este de aprox. Are 6 mm lungime și conține cea mai mare cantitate de ulei gras (15-30%) și proteine (20-30%). Din punct de vedere farmaceutic, totuși, amestecul de compuși din fruct, care este denumit în mod colectiv silimarină, este un complex chimic de flavonolignan. Principalul ingredient activ din miez este 12
silimarina concentrată conține cea mai mare cantitate (aproximativ 50%) de silibină (alias silibinin), dar și cantități semnificative de silicristină, silidianină și izosilibinină (Fig. 4). În timpul extracției, două faze, o pulbere solidă și o parte uleioasă lichidă, pot fi separate de semințele stem, care este fructul matur al plantei. Componenta de pulbere de silimarină utilizată în experimentele noastre a fost descrisă de Kuki și colab. (Kuki și colab. 2012) caracterizată prin spectrometrie de masă (HPLC-MS/MS) cuplată la cromatografie lichidă de înaltă performanță. În plus față de componentele majore ale flavonoidelor bioactive, cum ar fi silicristina A și B, silidianina, silibina A și B, izosilibina A și B, au fost detectate și trei componente suplimentare și parțial separate; probabil doi stereoizomeri de silibină și un stereoizomer de izosilibină (Kuki și colab. 2012). 13
Figura 4. Structura chimică a principalelor componente ale silimarinei (Kuki și colab. 2012) Uleiul de silimarină este un produs secundar al extracției semințelor de ciulin. Uleiul conține acizi grași esențiali, fosfolipide, steroli și cantități relativ mari de vitamina E (Hadolin și colab. 2001). Următoarele componente ale acidului gras au fost determinate din ulei de silimarină prin cromatografie gazoasă: acid linoleic (39%), acid oleic (36,7%), acid palmitic (10,1%), acid stearic (6,8%), acid linolenic (3,6%), arahidic acid (2,9%) și acid behenic (0,57%) (Fathi-Achachlouei și colab. 2016). 14
are o solubilitate redusă în apă (0,04 mg/ml). Solubilitatea sa în alți solvenți este următoarea: transcutol (350,1 mg/ml), etanol (225,2 mg/ml), polisorbat 20 (131,3 mg/ml), monooleat de gliceril (33,2 mg/ml) (Javed și colab. 2011). Silimarina este clasificată în conformitate cu sistemul de clasificare biofarmaceutică din anexa IV. clasă (solubilitate slabă, permeabilitate slabă), biodisponibilitate scăzută, care deseori împiedică utilizarea, în ciuda faptului că prezintă opțiuni terapeutice favorabile. În ultimii ani, o serie de cercetări s-au concentrat pe creșterea biodisponibilității silimarinei, modificarea solubilității, permeabilității, metabolismului și excreției complexului flavonoid. motive pentru biodisponibilitatea scăzută a silimarinei metabolismul de fază II cu permeabilitate redusă în celulele epiteliale ale intestinului subțire solubilitate redusă în apă Figura 5. Cauze ale biodisponibilității scăzute a silimarinei (Javed și colab. 2011) 17
2.3.4. Creșterea biodisponibilității silimarinei Deși materialul disertației mele nu include utilizarea de pulbere de silimarină sub formă de dozare orală, am vrut să ofer o revizuire a literaturii cu privire la metodele utilizate pentru a crește biodisponibilitatea sa până acum. O serie de soluții pot fi găsite în literatura de specialitate pentru o mai bună biodisponibilitate a pulberii de silimarină. Datele semnificative demonstrează că silimarina prezintă parametri farmacocinetici mult mai favorabili pentru derivații bine absorbiți (de exemplu, săruri, glicozide) și într-o formă de dozare adecvată, cum ar fi lipozom încorporat, dispersie solidă, nanosistem etc. (Figura 6). În secțiunea următoare, trec în revistă pe scurt evoluțiile care au încercat să rezolve dificultățile administrării orale a silimarinei. crește biodisponibilitatea complexării silimarinei cu derivați solubili în apă, de ex. săruri, glicozide dezvoltarea de noi forme de dozare Figura 6. Creșterea biodisponibilității silimarinei 2.3.4.1. Formarea silimarinei complexate Complexarea cu fosfatidilcolină Biodisponibilitatea extractului de sunătoare poate fi crescută atunci când este combinată cu un agent de complexare. Silibina în combinație cu fosfatidilcolina crește oral 18
Figura 7. Localizarea sistemului de microemulsie în sistemul ternar (sursă: Ujhelyi Z. Disertation. 2014) 2.3.7. Excipienți utilizați în formularea S (M) EDDS Componenta uleioasă ajută la auto-emulsificare și poate ajuta la absorbția ingredientului activ din tractul GI. Uleiurile naturale și trigliceridele cu lanț lung sunt utilizate în principal în formulare (Gowri și colab. 2012). Componenta uleioasă promovează transportul limfatic intestinal al medicamentului (Dixit și colab. 2010). Natura și proporția acestei componente sunt determinate cel mai mult de sistemele auto-emulsionante. Cu toate acestea, s-a demonstrat, de asemenea, că forma de dozare în sine poate crește absorbția și efectul terapeutic al componentei uleioase. (Zidan și colab. 2007, Gang și Yan 2011). Alegerea surfactantului (ionilor) neionic este preferată deoarece provoacă modificări ușoare și reversibile ale permeabilității peretelui intestinal. Concentrația acestei componente este de obicei: 30-60% în forma de dozare (Gowri și colab. 2012). Datorită proprietăților lor amfifile, solubilizează componentele hidrofobe, previn degradarea ingredientului activ și obțin un efect de lungă durată. Natura și concentrația agentului tensioactiv determină mărimea picăturilor după intrarea în mediul apos. 26
Al treilea grup de excipienți este cotensidele. Scopul lor este de a dizolva agenți tensioactivi hidrofili majori sau agenți hidrofobi în faza lipidică. De exemplu dietilen glicol monoetil eter, polietilen glicol. Creșterea concentrației de cotensidă ajută la eliberarea medicamentului din forma de dozare (Gowri și colab. 2012). 27
3. Examinarea consistenței cremelor cu un analizor de textură și examinarea eliberării in vitro a substanței active prin intermediul unei celule de difuzie Franz. 4. Studiu de citotoxicitate in vitro al cremelor de pe liniile celulare HeLa și HaCaT. 5. Determinarea valorilor TEWL într-un test de iritare in vivo la un model de cobai. 6. Investigarea efectului antioxidant al cremei in vitro asupra liniei celulare HaCaT și in vivo la cobai înainte și după iradierea UVB. 7. Determinarea activității enzimei HO-1 din țesutul pielii de cobai în pre- și post-tratament cu cremă împotriva radiațiilor UVB. 44
Pre-tratament grup isotonic CCl4 I.P. Eutanasierea și administrarea soluției de sodiu (7 zile) (7 zile injecție în ziua 8 (1,0 ml/kg) luxația gâtului în ziua 9) Grupa 1 - + - + Grupa 2 - + + + Grupa 3 SMEDDS po - + + 500 mg/kg Grupa 4 SMEDDS p.o. - + + 1000 mg/kg Grupa 5 SMEDDS p.o. - _ + 500 mg/kg Grupa 6 SMEDDS p.o. 1000 mg/kg - - + Tabelul 3: Protocol de tratament pentru experimentele SMEDDS care conțin ulei de silimarină în studii in vivo la șoareci 3.4.5. Determinarea valorilor enzimelor hepatice la șoareci Sângele colectat înainte de luxația cervicală a fost plasat într-un tub de heparină și centrifugat (15 min, 2000 g) pentru a obține plasmă. Probele de plasmă au fost testate imediat pentru activitatea alaninei aminotransferazei (ALT) și a aspartatului aminotransferazei (AST) prin măsurare spectrofotometrică folosind un kit (Roche, Franța), așa cum este descris de producător. 3.4.6. Prepararea extractului de proteine hepatice Pentru a prepara extractul total de proteine, 0,1 g de țesut hepatic au fost suspendate în tampon rece Tris-HCI 0,1 M (pH 7,4) conținând EDTA 5 mM și un cocktail inhibitor de protează adăugat proaspăt. Apoi într-o moară cu bile (tip MM 301, Retsch GmbH și 48
(Spectrofluorometru FP-6300 JASCO). Concentrația de malondialdehidă a fost determinată utilizând un standard de 1,1,3,3-tetrametoxipropan. Rezultatele sunt exprimate în nmol MDA/mg proteină. 3.5. Formularea și testarea unei creme care conține pulbere de silimarină 3.5.1. Formularea cremelor care conțin pulbere de silimarină Au fost folosiți diferiți emulgatori pentru formularea cremelor, cum ar fi Polisorbat 60 (P60), Cremophor A6 și A25 (C) într-un raport de 1: 1 și diferite tipuri de esteri ai zahărului (SP50, SP70, PS750 ). În timpul preparării cremelor de tip o/v, încălzirea (60 ° C) și amestecarea alcoolului cetil stearilic, acidului stearic și miropatului izopropil (IPM) au format faza uleioasă. Faza apoasă conținea propilen glicol, emulgator și apă purificată, care a fost încălzită la aceeași temperatură (60 ° C) și agitată pentru faza uleioasă. După omogenizare și răcire (25 ° C), Nipagin M și ingredientul activ, pulbere de silimarină, au fost adăugate la creme. Cremele conțineau 5% pulbere fie suspendată (compoziția I-V), fie dizolvată (compoziția VI-X). Pentru formulările dizolvate, pulberea de silimarină a fost dizolvată anterior în Transcutol HP (TC) (Tabelul 4). 51
Ingrediente dizolvate suspendate (g) I. II. III. ARC. V. VI. VII. VIII. IX. X. Silimarin 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 pulbere Transcutol - - - - - 14,2 14,2 14,2 14,2 14,2 Polisorbat 3 - - - - 3 - - - - 60 Cremofor - 3 - - - - 3 - - - A6: A25 (1: 1) Ester de zahăr - - 3 - - - - 3 - - SP50 Ester de zahăr - - - 3 - - - - 3 - SP70 Ester de zahăr - - - - 3 - - - - 3 PS750 Cetil stearil 4,6 alcool Stearic acid 10 Propilen glicol 5 Miropat de izopropil 5 Conservant 1 soluție Apă purificată dă 100 Tabelul 4. Compoziția cremelor de emulsie o/w conținând pulbere de silimarină 52
diferențe p P60> SP50> PS750 = C. Pe ambele linii celulare HeLa și HaCaT, crema care conține emulgator SP70 a fost cel mai bine tolerată, cu viabilitatea celulară de 68,45% ± 0,6 pe HeLa și 63,7 ± 0,6% pe celulele HaCaT. Rezultatele viabilității celulare au fost comparate cu controlul pozitiv TritonX-100. 72
Figura 17. Testul MTT este rezultatul viabilității celulare pe celulele HaCat și HeLa după tratamentul cu compoziții de cremă care conțin silimarină (I-X). Fiecare valoare arată media ± S.D, n = 10. Datele au fost evaluate utilizând o metodă Anova cu mai mulți pasageri, iar comparațiile între grupuri au fost efectuate utilizând corelația persană. În figura cu un asterisc * (pag
- 8298 Ft - Marnys MEGA 2000 supliment alimentar lichid cu aromă de miere care conține lăptișor de matcă 20x10ml -
- Amprenta de carbon a unei diete cu conținut scăzut de carne este mai mică decât cea a unui vegetarian tradițional -
- 8310 Ft - Pulbere supliment alimentară care conține floră vie microbiom-11 cu inulină și îndulcitori
- 2504 Ft - Capsule de supliment alimentar care conțin Linex Complex flora vie 14buc - Egészségpláza Budapest
- Succesul fertilizării in vitro la pacienții cu endometrioză intestinală - un științific