Generarea și caracterizarea de noi linii celulare din tumori experimentale induse de agenți cancerigeni chimici

DOCTORATUL UNIVERSITĂȚII (dr.) DISERTARE György Trencsényi Crearea și caracterizarea noilor linii celulare din tumori experimentale induse de agenți cancerigeni chimici Supraveghetori: Prof. Dr. Gáspár Bánfalvi Prof. Dr. János Hunyadi UNIVERSITATEA DOCTORULUI DEBRECEN

liniilor

Cuprins 1. Introducere 7 2. Revizuirea literaturii 10 2.1. Carcinogeni chimici 10 2.1.1. Mecanismul de acțiune al agenților cancerigeni chimici 11 2.1.2. N-nitrozodimetilamină (DMNA) 13 2.1.3. 7,12 - Dimetilbenz (a) antracen (DMBA) 17 2.2. Transplantul tumorilor experimentale 19 2.3. Modele de metastază 20 3. Materiale și metode 24 3.1. Substanțe chimice și soluții utilizate 24 3.2 Animale experimentale 25 3.3 Tumori experimentale 25 3.4. Procedura chirurgicală 26 3.5. Stabilirea unei linii de celule tumorale 27 3.6. Izolarea celulelor fibroblaste de la șobolani Fischer 344 28 3.7. Izolarea celulelor hepatocitare din ficatul de șobolan Fischer 344 28 3.8. Examinarea celulelor hepatice regenerante 29 3.9. 18 Măsurători de acumulare FDG 29 3.10. Imunocitochimie 31 3.11. Imunohistochimie 31 3.12. Analiza Western blot 32 3.13. Măsurători citometrice de debit 32 3.14. Izolarea structurilor cromatinei 33 3.15. Prelucrarea datelor 34 4. Rezultate 35 4.1. Carcinom hepatocelular (He/De) 35 4.1.1. Celulele de carcinom hepatocelular el/marcate încep să crească sub forma unei tumori solide atunci când sunt implantate sub capsula renală a șobolanilor F344 35 2

Lista abrevierilor: 18 FDG: 2- [18 F] fluor-2-deoxi-D-glucoză 18 FDG-6-P: 2- [18 F] fluor-2-deoxi-D-glucoză-6-fosfat ATCC: American Type Culture Collection DAPI: 2,6-diamino-2-phenylindole DMBA: 7,12-dimethylbenz (a) anthracene DMNA: N-nitrosodimethylamine, dimethylnitrosamine DSMZ: Deutsche Sammlung von Microorganisms und Zellkulturen GmbH (Colecția germană de microorganisme și culturi celulare) ) FBS: ser de vițel fetal FITC: izotiocianat de fluoresceină GLUT: transportor de glucoză H&E: colorare hematoxilină-eozină He/De: carcinom hepatocelular de șobolan ip: ID intraperitoneal%: doză de incubare% radioactivitate până la 10 celule iv: intravenos My1/De: șobolan mielomonoblastic leucemie Ne/De: nefrom mesoblastic de șobolan PET: Tomografie cu emisie de pozitroni ROI: Regiune de interes sc: subctan (subcutanat) SDS: sodiu dodecil sulfat SGLT: cotransportor sodiu/glucoză SPECT: (Tomografie computerizată cu emisie de fotoni unici) este o emisie de fotoni tomografie OMS: Organizația Mondială a Sănătății 6

necesită un număr neobișnuit de mare de control voluntar și grupuri tratate din studiile clinice de farmacologie, iar rezultatele pot fi evaluate numai după mulți ani, chiar și decenii. Acestea sunt dificultățile metodologice care fac ca cercetarea științifică a chemoprevenției să fie atât de dificil de avansat. Experimentele pe care le-am efectuat în ultimii ani au servit simplificării și fiabilității studiilor preclinice. Am vrut să dezvoltăm o metodă care să ofere rezultate fiabile într-o perioadă relativ scurtă de timp la relativ puține animale, luând în considerare toate cele trei tipuri de tumori și monitorizând metastazele care se dezvoltă. În aceste studii, am considerat cel mai potrivit sistem experimental în care celulele hepatocarcinoamelor, nefromelor mezoblastice și leucemiilor mielomonoblastice induse de cancerigenii chimici au fost

liniile celulare pot fi dezvoltate din cultura care poate fi menținută înghețată și reimplantată sub rinichi. 2. Am vrut să dovedim că 10 6 celule tumorale induse chimic transplantate sub un caz de rinichi formează metastaze ale ganglionilor limfatici în toate cazurile și ne-am propus să determinăm timpul necesar dezvoltării metastazei. 3. Am vrut să studiez distribuția celulelor tumorale induse chimic prin metode imagistice. Scopul a fost de a compara cele trei tipuri de tumori generate chimic și mecanismul de absorbție a 18 FDG ale celulelor normale și de a demonstra că metodele de diagnostic al tumorii cu 18 radiofarmaceutice FDG, care au fost dovedite în practica umană, pot fi utilizate în tumorile induse chimic și șobolanii lor . 4. Am vrut să investigăm structura cromatinei, procesele de condensare a cromatinei și diferențele acestora în comparație cu celulele normale și celulele hepatice regenerante în celulele tumorale de hepatocarcinom induse chimic. 9

Unii agenți cancerigeni acționează direct fără transformări chimice (de exemplu, dimetil sulfat), dar majoritatea acționează după activarea enzimatică și biotransformare (monoaminooxidazele dependente de citocromul P-450). În acest proces, procarcinogenul ineficient produce mai întâi un carcinogen intermediar cu acțiune slabă și apoi un carcinogen final cu acțiune puternică. Studiile analitice au arătat că legarea agenților cancerigeni finali la atomii de oxigen și azot 6 ai guaninei, atomii de azot 1, 3 și 7 ai adeninei, atomii de azot 3 ai citozinei și azotul 4 al timinei cel mai frecvent pe atomul său de oxigen. Figura 1. Schema generală a mecanismului de acțiune al agenților cancerigeni chimici (după Hill, 1987) Datorită scopului limitat al disertației, discut în detaliu mecanismul de acțiune și efectul a doar doi agenți cancerigeni pe care îi folosim, dimetilnitrosamina și 7,12-dimetilbenzen (a) antracen. 12

formând astfel 7-nitrometilguanină (N 7-MeG) sau 6-oximetilguanină (O 6-MeG) (Figura 3). O 6 -MeG se comportă ca și cum ar fi adenină și formează o pereche de baze cu timina. Astfel, în timpul diviziunilor celulare succesive, perechea GC originală devine mai întâi o pereche de 6-oximetil guanină timină și apoi o pereche de adenină timină, schimbând astfel codul. Figura 3. Produși induși de DMNA Literatura despre bolile cauzate de DMNA uman este foarte slabă, dar se știe că incidența necrozei acute este crescută la persoanele expuse la DMNA și că expunerea timp de doi ani provoacă ciroză (Freund, 1937). Acest compus poate fi, de asemenea, responsabil pentru numărul mare de tumori esofagiene și gastrice observate în Africa. 16