TEZĂ DE DIPLOMĂ Zsolt Gábor Nagy Programul de masterat în știința nutriției 2012

Universitatea Semmelweis, Facultatea de Științe ale Sănătății și Universitatea Corvinus din Budapesta, Facultatea de Științe Alimentare Investigarea contaminării cu gluten a alimentelor care pot fi consumate de persoanele sensibile la gluten și compararea metodelor de măsurare a conținutului de gluten Zsolt Gábor Nagy Profesor asociat Masterat în nutriție 2012, Supervizor: Dr. V

Cuprins Cuprins. 2 Rezumat. 4 1. Introducere. 6 2. Revizuirea literaturii. 8 2.1 Introducere în gluten. 8 2.2 Introducere în boala celiacă (sensibilitate la gluten). 11 2.2.1 Epidemiologia bolii. 11 2.2.2 Patomecanismul bolii celiace. 12 2.2.3 Detectarea bolii celiace. 15 2.3 Reglementarea legală a conținutului de gluten. 16 2.4 Evoluția metodelor de determinare a conținutului de gluten. 21 2.4.1 Cerințe pentru metodele de măsurare. 21 2.4.2 Factori care influențează măsurarea. 21 2.4.3 Metoda microscopică. 22 2.4.4 Metode electroforetice. 23 2.4.5 Metoda cromatografică. 24 2.4.6 Metode imunologice. 28 2.4.7 Reacția în lanț a polimerazei (PCR). 33 2

3. Investigarea independentă a contaminării cu gluten. 35 3.1 Obiectivul cercetării. 35 3.2 Subiectul studiului. 35 3.3 Ipoteze. 35 3.4 Prezentarea unei metode pentru determinarea Ѡ-gliadinei. 36 3.5 Introducere în metoda R5. 40 3.6 Prezentarea eșantionării. 45 4. Rezultate. 46 4.1 Modificări de culoare pe microplacă. 46 4.2 Compararea metodelor TEPNEL și R5. 47 4.3 Contaminarea cu gluten a produselor din ovăz. 49 4.4 Contaminarea cu gluten a făinurilor. 50 4.5 Contaminarea cu gluten a alimentelor pentru utilizări nutriționale speciale. 52 4.6 Contaminarea cu gluten a produselor organice. 53 5. Discuție. 54 6. Concluzii și recomandări. 57 Rezumat. 62 Referințe. 63 Mulțumiri. 68 Clauza. 69 Anexe. 3

2. Revizuirea literaturii 2.1 Introducere în gluten Produsele fabricate din cereale (grâu, orz, secară, ovăz) constituie baza consumului de alimente din Ungaria. Din punct de vedere fitologic, cerealele aparțin ierburilor și au multe ramuri înrudite (Fig. 1). Datorită originii lor comune, aceste specii înrudite sunt aceleași în anumite privințe și diferă în anumite caracteristici. Cifra arată că sucul de grâu, secară, orz și triticale aparține unui grup taxonomic. Acest lucru este confirmat de compoziția proteinelor lor, de proprietățile lor similare. Pe măsură ce ne îndepărtăm de acest grup taxonomic (de exemplu, orez), compoziția și alergenicitatea proteinelor vegetale se schimbă (Takács, 2008). Figura 1: Arborele de rudenie în cazul cerealelor și pseudocerealelor (Takács, 2008) Grâul este cea mai cultivată cereală din agricultura maghiară. Structura ochiului este diversă, părțile principale sunt endospermul, peretele fructului, embrionul (Fig. 2). 8

Figura 2: Secțiunea longitudinală a boabelor de grâu (Tímár & Matuz, 1996) Endospermul reprezintă 82-86% din greutatea boabelor de grâu. Această parte este semnificativă deoarece proteinele care sunt utilizate imediat și stocate între granulele de amidon sunt formate și stocate aici. Proteinele endospermice au fost clasificate pentru prima dată de Osborne pe baza solubilității lor (Osborne, 1907): proteine solubile în apă: albumine proteine solubile în sare: globuline proteine solubile în alcool: proteine gliadine solubile în acizi și alcali: glutenine Din aceste proteine, glutenul și gluten împreună). Această moleculă de polimer are proprietăți structurale unice: podurile de tiol și sulfură previn scurgerea amidonului din coloana vertebrală a proteinei, chiar și în perioade de secetă și stres termic. Acest lucru este de o mare importanță din punct de vedere al coacerii: dacă glutenul devine umezit, se creează o structură polimerică reticulată care nu permite trecerea bulelor de gaz produse de drojdii și astfel pâinea crește. Proteinele din gluten pot fi grupate în continuare prin metode analitice. Figura 3 prezintă rezultatele diferențierii prin metode convenționale și moleculare. 9

Figura 3: Comparația clasificărilor tradiționale (funcționale) și noi (moleculare) ale proteinelor glutenice (Shewry, Tatham, Forde, Kreis, Miflin, 1986) Următoarele grupuri pot fi distinse printr-o metodă convențională (examinarea funcționalității): Gliadine monomerice (Ѡ -gliadine, alfa-gliadine, Ƴ-gliadine) Glutenine agregate (subunități cu greutate moleculară mică, subunități cu greutate moleculară mare) Pe baza studiului compoziției moleculare, membrii acestor grupuri pot fi împărțiți în alte categorii de grupuri: prolamine sărace în sulf: Ѡ-gliadine Gaminine bogate în sulf, alfa-ginsine:, subunități cu greutate moleculară mică Prolamine cu greutate moleculară mare: subunități cu greutate moleculară mare Prolaminele care sunt specifice speciilor pot fi detectate și în alte cereale: hordină de orz, avenină în secară, secalin în secară, prolamină tipică în zeina porumbului (Tímár & Matuz, 1996). Pe scurt, glutenul este o fracțiune proteică derivată din grâu, secară, orz, ovăz și rasele lor încrucișate și derivații lor, care nu pot fi tolerate de anumite persoane și care este insolubilă în apă și soluție de clorură de sodiu 0,5 M. 10

Ungaria: 1:80 (copii) Italia: 1: 100 1: 300 (copii) Suedia: 1: 285 (copii) și 1: 500 (adulți) Norvegia: 1: 285 (adulți) Irlanda: 1: 300 (adulți) Irlanda de Nord: 1: 122 (adulți) Croația: 1: 520 (copii) 2.2.2 Patomecanismul bolii celiace Glutenul care intră în tractul gastrointestinal în timpul bolii celiace induce procese autoimune în intestinul subțire, rezultând atrofia membranelor mucoase și a vilozităților intestinale (Figura 4).). Modelul pufului se aplatizează, criptele se alungesc, se măresc și activitatea mitotică crește în celulele lor (Fig. 5). Epiteliul de suprafață se aplatizează și activitatea enzimatică scade. Figura 4: Rezultatele endoscopice și biopsice la oameni sănătoși (A, B) și celiaci (C, D). (JOHN PRESUTTI și colab., 2007) 12

Figura 5: Suprafața viliilor intestinale A a unei persoane sănătoase și suprafața viliilor intestinale B a unui pacient sensibil la gluten (Ludvig, 2002) Proliferează limfocitele intraepiteliale, urmate de activarea ridicată a celulelor T. Gliadina care formează gluten, când intră în organism, se leagă de transglutaminaza tisulară (o enzimă dependentă de calciu activă în citosol) din intestinul subțire. Transglutaminaza tisulară deamidează peptidele gliadinei, rezultând formarea epitopilor peptidici (de care se poate lega și proteina HLA-DQ2). Complexul nou format inițiază producerea de autoanticorpi conduși de celulele T CD4 +, în urma cărora organismul produce anticorpi împotriva propriilor sale celule, distrugând astfel vilozitățile intestinului subțire. Atrofia mucoasei intestinului subțire va avea ca rezultat inversarea crescută a nutrienților absorbție și în timp.secreție. Deteriorarea absorbției duce la probleme anormale de funcționare și deficiență în mai multe părți ale corpului. 13

2.2.3 Detectarea bolii celiace Recunoașterea și detectarea bolii celiace este rezultatul unui proces în mai multe etape. 1. Recunoașteți simptomele bolii 2. Detectarea anticorpilor în organism (IgA EMA, ttg) 3. Biopsia intestinului subțire În lumina testelor efectuate, boala celiacă este probabilă dacă sunt prezente cel puțin 3 dintre următoarele. (Korponay-Szabó, 2008): dieta fără gluten îmbunătățește simptomele clinice prezența pozitivității anticorpilor endomisiu sau transglutaminază a inflamației HLA-DQ2 sau HLA-DQ8 în intestinul subțire caracterizată prin creșterea numărului de limfocite intraepiteliale 3 tipuri de boală celiacă: există dar pacientul este asimptomatic. EMA/ttg poate prezenta un rezultat pozitiv (seropozitivitate), dar nu atrofie. boala celiacă silențioasă: există seropozitivitate și atrofie aglomerată, dar pacientul este asimptomatic. Cu toate acestea, pot fi depistate carența de fier, anemia, osteoporoza. boală celiacă activă: atrofie severă de cohortă, seropozitivitate cu titru ridicat și simptome clinice tipice/atipice. 15

excesul de gluten din alimentele vândute consumatorului final. ovăzul conținut în acesta este special pregătit, preparat și/sau prelucrat în așa fel încât să se evite contaminarea cu grâu, secară, orz sau soiuri încrucișate ale acestora, iar conținutul de gluten al acestor ovăz nu trebuie să depășească 20 mg/kg. 2. Termenul „gluten foarte scăzut” poate apărea pe ambalajul sau etichetarea unui produs dacă acesta conține sau constă din unul sau mai multe ingrediente obținute din grâu, secară, orz, ovăz sau rasele lor încrucișate, obținute printr-un proces special pentru reduce conținutul de gluten. au fost reduse și nu conțin mai mult de 100 mg/kg de gluten în alimentele vândute consumatorului final. Legile și directivele adoptate de Uniunea Europeană sunt încorporate continuu în sistemul juridic maghiar în timpul armonizării juridice a legislației și sistemului juridic maghiar. 20