Determinarea conținutului de ouă din pastele uscate prin ELISA

Teza studenților științifici VIKTÓRIA VARGA EVELIN Determinarea conținutului de ouă din aluatele uscate de către ELISA Supervizor: Zsuzsanna Eke, dr. Departamentul de chimie analitică Separare tehnologie Laborator de cercetare și predare Universitatea Eötvös Loránd Facultatea de Științe din Budapesta, 2011-1 -

Cuprins 1. Introducere. 3 2. Revizuirea literaturii. 4 2.1 Compoziția oului. 4 2.1.1 Albus de ou. 4 2.1.2 Gălbenușul de ou. 4 2.2 Determinarea conținutului de ouă din pastele uscate. 5 2.2.1 Determinarea conținutului de colesterol. 5 2.2.2 Determinarea albusurilor. 6 2.2.3 Metode de amestecare. 7 2.3 ELISA. 7 3. Obiectiv. 11 4. Partea experimentală. 12 4.1 Materiale și instrumente. 12 4.1.1 Set ELISA. 12 4.1.2 Alte instrumente utilizate. 12 4.1.3 Probele. 13 4.1.3 Fabricarea aluatului. 14 4.2 Pregătirea probei. 15 4.3 Procedura de testare. 17 4.4 Evaluarea rezultatelor. 17 5. Rezultate proprii. 19 5.1 Pastele de casă. 19 5.2 Cumpărați produse de patiserie. 20 5.3 Aluaturi făcute cu ouă diferite. 22 5.5 Probleme cu pastele uscate cu un conținut ridicat de ouă. 26 Mulțumiri. 30 Referințe. 31-2 -

1. Introducere Conform regulilor din Cartea alimentară maghiară (MÉK), pastele uscate pot fi obținute din Triticum aestivum (grâu comun) sau Triticum durum (grâu dur) cu sau fără ou măcinat, cu adăugare de apă și, eventual, alte plăceri sau aditivi nutriționali [1]. Calitatea, proprietățile fizice și plăcute ale pastelor obținute cu ouă depind în principal de conținutul lor de ouă, iar ouăle conțin, de asemenea, multe minerale importante pentru corpul uman. Prin urmare, este foarte important ca cumpărătorii să știe că cumpără într-adevăr un preparat de paste uscate de calitate, așa cum este indicat pe ambalaj. Prin urmare, din punct de vedere al controlului calității, este important să puteți determina cu exactitate conținutul de ouă al acestor produse folosind metode analitice adecvate. Pastele făcute folosind ouă în conformitate cu Cartea de alimente maghiară [1] stipulează că cel puțin la fel de multe ouă pe ou în acest caz înseamnă 45 g de ouă fără coajă - acestea trebuie să conțină per kg de paste uscate, cu cât numărul de ouă de pe pachet indicat. Dezvoltarea unei metode analitice suficient de precise pentru a verifica acest lucru este încă o provocare astăzi. - 3 -

2. Revizuirea literaturii 2.1 Compoziția ouălor Ouăle, cu excepția vitaminei C, conțin toți nutrienții necesari organismului uman. Practic, este format din trei părți: coaja de ou (

60%) și gălbenuș de ou (

Figura 1: Tava suportului de celulă cu 16x8 locuri. Imaginea prezintă 17 celule detașabile. În timpul ELISA sandwich (Figura 2), anticorpii specifici pentru antigen, adică analitul din probă, sunt atașați la suprafața fazei solide în aceeași cantitate din fiecare godeu. La adăugarea probei, antigenii care vor fi detectați în aceasta se vor lega în mod specific de anticorpi. Alte componente în exces nelegate ale probei sunt apoi îndepărtate de obicei prin etapele de spălare. Aceasta este urmată de adăugarea unui al doilea anticorp legat de enzimă care se leagă în mod specific de un alt epitop al antigenului (situsul de legare a anticorpului moleculei de antigen). Astfel, antigenul nostru va fi intercalat între cei doi anticorpi. În cele din urmă, se adaugă un substrat cromogen pentru enzima atașată la al doilea anticorp, a cărui conversie enzimatică este însoțită de o schimbare de culoare. La sfârșit, reacția este oprită cu un acid slab, urmată de măsurare fotometrică. Cu cât eșantionul nostru conține mai mult antigen, cu atât culoarea obținută este mai puternică, astfel semnalul măsurat va fi proporțional cu concentrația substanței măsurate în probă. Cuantificarea se realizează pe baza unei curbe standard obținute din seria de diluare a unei soluții cu o concentrație cunoscută a moleculei țintă. - 8 -

Valorile obținute din ELISA pentru determinarea proteinelor din matricile alimentare complexe pot fi foarte distorsionate. Pot exista mai multe motive pentru aceasta. Rezultate false negative pot apărea cu extracția necorespunzătoare din matricea alimentară. ELISA este adecvat numai pentru detectarea proteinelor intacte, deci dacă o proteină, chiar dacă doar într-o măsură limitată, este hidrolizată, imunoreactivitatea ELISA împotriva acesteia se poate pierde. Proteinele care urmează să fie determinate și epitopii lor importante pentru ELISA pot fi modificate chimic în unele alimente în timpul procesării alimentelor, ceea ce poate duce, de asemenea, la o scădere a imunoreactivității testului [29]. Proteina care trebuie detectată poate interacționa cu alte componente ale matricei alimentare. Acest lucru poate determina scăderea imunogenității și, prin urmare, nu este detectat. Alte componente ale matricei alimentare pot, de asemenea, să reacționeze încrucișat cu anticorpi specifici proteinelor care trebuie detectate, rezultând un rezultat fals pozitiv. Pastele uscate sunt o matrice alimentară relativ simplă (vezi capitolul 1). Probabilitatea unor posibile reacții încrucișate a componentelor matricei și a interacțiunilor cu proteinele care urmează să fie detectate este, prin urmare, semnificativ mai mică. - 10 -

3. Obiectiv În Ungaria, o metodă analitică suficient de precisă pentru determinarea conținutului de ouă din pastele uscate este încă o provocare. Cu toate acestea, este clar că orice metodă analitică adecvată scopului trebuie să se bazeze pe măsurarea unei componente specifice ouălor. ELISA este adesea utilizat pentru a determina conținutul de albuș de ou din alimente. Această metodă este simplă, sensibilă și foarte specifică. Este ușor standardizat și automatizat, permițând testarea unor volume mari de probe. Prin urmare, obiectivul meu a fost să aflu, folosind un kit ELISA standardizat pentru determinarea albușurilor din diferite alimente, că un ELISA specific pentru mai mult de un albuș de ou poate fi potrivit pentru determinarea conținutului de ouă al acestor paste uscate. - 11 -

complet uscat. După ce am uscat complet aluatele, le-am cântărit greutatea exactă unul câte unul. În fiecare caz, am recalculat conținutul de ouă la 1 kg din greutatea exactă a ouălor după uscare și în timpul preparării. Conținutul de ou a fost dat în fiecare caz în numărul de bucăți, unde o bucată de ou înseamnă 45g de ouă fără coajă. 4.2 Pregătirea probei Înainte de utilizare, tamponul de extracție obținut sub formă de concentrat de 10 ori a fost plasat mai întâi într-o baie de apă la 37 o C timp de câteva minute pentru a dizolva cristalele prezente, apoi omogenizat prin agitare bine. Am diluat apoi de 10 ori cu apă distilată. - 15 -

ca o funcție a. Am montat o linie pătratică la punctele arătate și apoi am calculat conținutul de ouă măsurat al aluatelor pe baza ecuației acestei linii. - 18 -

Concentrația (ppm) între concentrația de albus de ou și conținutul indicat de ouă, nu poate fi ajustată direct la punctele indicate. Am măsurat, de asemenea, trei tipuri diferite de aluat din cele 8 aluaturi de ouă și am efectuat trei măsurători repetate din aceste 8 aluaturi de stivă de ouă (S8b/1, S8b/2, S8b/3). Procentul de RSD al concentrației de albus obținut din măsurători repetate a aluatului de 8 stive a fost de 1,09%. % RSD calculat din rezultatele concentrației de proteine din ouă pentru toate cele 8 tăiței de ouă, care include, de asemenea, valoarea excepțional de scăzută a tăiței din cele opt tăiței de ouă, deși 10,73% 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 12 Ou conținut (buc) Figura 5: Pe baza valorilor de absorbanță ale aluatelor din depozit prezentate în Tabelul 1, concentrația de albuș de ou calculată de software-ul Ridawin este reprezentată grafic în funcție de conținutul de ouă al fiecărui aluat. - 21 -

se schimbă într-o asemenea măsură încât se schimbă semnificativ. Cu toate acestea, conținutul de proteine al ouălor din diferite locații poate varia foarte mult. Deși ELISA singur nu s-a dovedit a fi o metodă adecvată pentru determinarea conținutului de albuș de ou din pastele uscate, împreună cu măsurătorile altor constituenți de ou, atunci când este utilizat într-o metodă combinată, poate juca în continuare un rol important în determinarea conținutului de ou Paste. - 29 -

Mulțumiri Aș dori să îi mulțumesc dr. Zsuzsanna Eke pentru ajutorul și sfaturile utile pe care le-a oferit în pregătirea disertației mele. - 30 -

[24] Ľ. Zemková, J. Simeonovová, M. Lichovníková, K. Somerlíková, ceh J. Anim. Sci., 52 (2007) 110-115. [25] F. Kwasnicka, Electrophoresis, 24 (2003) 860-864 [26] N. Schneider, C. M. Becker, M. Pischetsrieder, J. Chrom. B, 878 (2010) 201-206. [27] Z. H. Reed, J. W. Park, Food Chem., 118 (2010) 575-581 [28] Y. Watanabe, K. Aburatani, T. Mizumura, S. Muraoka, J. Imm. Methods, 300 (2005) 115-123 [29] S. L. Taylor, J. A. Nordlee, L. M. Niemann, Anal. Bioanal. Chem., 395 (2009) 83-92 [30] C. D. Amigo, Anal. Biol. Chem., 3 (2010) 344-350-32 -