Studiu genetic și clinic molecular al galactozemiei clasice, al deficitului de galactokinază și al deficitului de biotinidază.

S KoA. a, R-COOH + ATP + CoA R C

Studiu genetic și clinic molecular al galactozemiei clasice, al deficitului de galactokinază și al deficienței de biotinidază Disertație doctorală Universitatea Milánkovics Ilona Semmelweis Școala Doctorală de Medicină Moleculară Pregătită de: Universitatea Semmelweis, II. Liderul programului Departamentului de Pediatrie: Dr. András Falus, profesor, doctor al Academiei Maghiare de Științe Supraveghetori: Dr. Veronika Karcagi, șef de departament, dr. Dr. Ágnes Schuler, medic șef, dr. Comitetul de examinare: Președinte: Dr. Endre Cserháti, profesor universitar, doctor al Academiei Maghiare de Științe Membri: Dr. Csaba Szalai, cercetător principal, doctor al Academiei Maghiare de Științe Dr. Eszter Karg, cercetător asociat, dr. Dr. Judecători oficiali: Dr. . Éva Oláh, profesor universitar, doctor al Academiei Maghiare de Științe Dr. Károly Rácz, profesor universitar, doctor al Academiei Maghiare de Științe din Budapesta, 2010

Cuprins Cuprins Lista abrevierilor 5 1. Introducere 6 2. Revizuirea literaturii 7 2.1. Boli metabolice congenitale 7 2.1.1. Patogenia și clinica bolilor metabolice congenitale 7 2.1.2. Principalele grupuri de boli metabolice congenitale 9 2.1.3. Terapia pentru bolile congenitale metabolice 12 2.2. Galactozemia 13 2.2.1. Metabolismul galactozei 13 2.2.2. Galactozemie clasică 14 2.2.3. Moștenirea galactozemiei clasice 15 2.2.4. Deficiența de galactokinază 17 2.2.5. Moștenirea deficitului de galactokinază 17 2.2.6. Deficiența UDP-galactoză-4-epimerază 19 2.2.7. Moștenirea deficitului de UDP-galactoză-4-epimerază 20 2.2.8. Terapia și îngrijirea galactozemiei 21 2.3. Deficiența de biotinidază 23 2.3.1. Ciclul biotinei 23 2.3.2. Deficiența de biotinidază 24 2.3.3. Moștenirea deficitului de biotinidază 25 2.3.4. Terapia și îngrijirea deficitului de biotinidază 27 2.4. Depistarea în masă neonatală 28 2.4.1. Începutul screeningului de masă neonatală 28 2.4.2. Screeningul de masă neonatală în Ungaria 29 2.4.3. Screening neonatal în masă pentru galactozemie 30 2.4.4. Depistarea în masă neonatală a deficitului de biotinidază 31 2.5. Semnificația studiilor genetice moleculare 33 3. Obiective 35 4. Metode 37 4.1. Pacienți studiați 37 4.1.1. Galactozemie clasică 37 4.1.2. Deficitul de galactokinază 37 4.1.3. Pacienți suplimentari depistați pentru niveluri ridicate de galactoză 38 2

Lista abrevierilor Lista abrevierilor A: adenină BTD: biotinidază C: citozină D1: Duarte-1, varianta Los Angeles D2: Duarte-2, variantă Duarte EDTA: acid etilendiaminetetraacetic ELISA: test imunosorbent legat de enzime G *: alelă clasică de galactoză G: guanină G-1-P: glucoză-1-fosfat G-6-P: glucoză-6-fosfat G-6-PDH: glucoză-6-fosfat dehidrogenază GALE: uridil difosfat galactoză-4-epimerază GALK: galactocinază GALT: galactoză-1-fosfat uridiltransferază IVS: variație a secvenței intronului LTFU: urmărire pe termen lung urmărire pe termen lung MIM: Moștenire mendeliană la om N: alelă normală NADP: nicotinamidă adenină dinucleotidă fosfină nedetectată OD: densitate optică acid aminobenzoic PCR: reacție în lanț a polimerazei 6-PGA: 6-fosfogluconat 6-PGD: 6-fosfogluconat dehidrogenază PKU: fenilcetonurie R-5-P: ribuloză-5-fosfat RFLP: lungime fragment de restricție polimorfism STFU: urmărire pe termen scurt urmărire pe termen scurt T: timină UDP-galactoză: uridil difosfat-galactoză UDP-glucoză: uri glucoză dildifosfat OMS: Organizația Mondială a Sănătății 5

Revizuirea literaturii Frecvența internă a galactozemiei clasice este de 1: 46.000, ceea ce corespunde incidenței la populația caucaziană [Schweitzer-Krantz, 2003; Bosch și colab., 2005]. 2.2.3. Moștenirea galactozemiei clasice Galactozemia clasică este o boală monogenică autozomală moștenită recesiv. Gena GALT care codifică enzima galactoză-1-fosfat uridil transferază este localizată pe brațul scurt al cromozomului 9 (9p13), are o lungime de aproximativ 4,3 kb și conține 11 exoni (Figura 2) (Leslie și colab., 1992). Peste 180 de mutații clasice cauzatoare de galactozemie au fost descrise în literatură [Tyfield și Carmichael]. Trei dintre aceste mutații fără sens (p.q188r, p.k285n și p.n314d) sunt extrem de frecvente în populația caucaziană. Frecvența globală a alelelor celor trei mutații la pacienții din unele țări ajunge la 80-90% [Tyfield, 2000]. Figura 2 A: Localizarea genei GALT pe cromozomul 9 (sursa: www.genecards.org) B: Structura genei GALT (sursa: www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas) C: Structura genei GALT cdns, localizarea mutațiilor p.q188r, p.k285n și p.n314d pe cdns Cea mai frecventă mutație la pacienții cu galactozemie clasică este mutația p.q188r (c.563a> g), care este prezentă în exonul 6, 188 determină un schimb de glutamină/arginină la codon (Fig. 2). Frecvența alelei mutației în Europa de Vest a fost de 15

Revizuirea literaturii 2.2.7. Moștenirea deficitului de UDP-galactoză-4-epimerază Deficiența de UDP-galactoză-4-epimerază este, de asemenea, moștenită într-o manieră autosomală recesivă. Gena GALE care codifică enzima este localizată pe brațul scurt al cromozomului 1 (1p36-p35) [Benn și colab., 1979; Lin și colab., 1979; Daude și colab., 1995], are o lungime de aproximativ 4 kb și conține 11 exoni (Figura 4). Codonul ATG care codifică metionina inițială a enzimei este situat la exonul 2 [Maceratesi și colab., 1998]. Până în prezent, în literatura de specialitate au fost descrise aproximativ 20 de mutații diferite care cauzează deficit de UDP-galactoză-4-epimerază [Wohlers și colab., 1999; Henderson și colab., 2001; Park și colab., 2005]. Figura 4 A: Localizarea genei GALE pe cromozomul 1 (sursa: www.genecards.org) B: Structura genei GALE (sursa: www.dsi.univ-paris5.fr/genatlas) C: Structura genei GALE cdns 20

Revizuirea literaturii 2.3. Deficitul de biotinidază 2.3.1. Ciclul biotinei Biotina este o vitamină esențială, hidrosolubilă, din complexul B (vitamina H) care acționează ca un cofactor pentru patru enzime carboxilază din corpul uman [Thoma, 1954; Pispa, 1965]. Cu o dietă normală, doar o cantitate minimă de biotină pătrunde în corpul nostru. Deși anumite alimente (ficat, rinichi, făină, făină de soia, gălbenuș de ou, drojdie) conțin cantități mai mari de vitamina H, consumul mai mare al acestora nu acoperă nici nevoile umane. Pentru ca biotina să fie prezentă în concentrația corectă din corpul nostru, este necesar ciclul biotinei, care permite utilizarea moleculei de mai multe ori (Figura 5). Figura 5. Ciclul biotinei Biotina pătrunde în corpul nostru prin alimente sub formă proteică sau liberă. Grupul carboxil al moleculei este legat covalent printr-o legătură amidică de enzima holocarboxilază sintetază (EC 6.3.4.10) în fiecare caz de o lizină-amino 23

Revizuirea literaturii 2.3.4. Terapie și îngrijire pentru deficitul de biotinidază Deficitul de biotinidază este tratat prin substituție de biotină. Diagnosticul precoce (vezi pct. 4.5) și inițierea precoce a tratamentului sunt extrem de importante pentru a evita afectările ireversibile, cum ar fi pierderea auzului, deficiența vizuală sau întârzierea mintală. Doza farmacologică este de 5-20 mg de biotină pe zi, în funcție de gravitatea simptomelor. Terapia elimină adesea simptomele reversibile ale bolii într-un mod foarte spectaculos în câteva săptămâni [Mock et al., 1985; Swick și Kien, 1985] (Fig. 7). Figura 7. Efectul terapiei cu biotină la copiii cu deficit de biotinidază A: După 15 zile de substituție a biotinei, simptomele severe ale pielii s-au îmbunătățit semnificativ (sursă: Mock și colab., 1985) B: după șase luni de terapie cu biotină, simptomul alopeciei a dispărut complet (sursa: Swick și Kien, 1985)) 27

Metodologia revizuirii literaturii [Knappe și colab., 1963], Heard și colab. a fost dezvoltat în continuare într-o metodă de screening în masă, care permite diagnosticarea deficitului de biotinidază la câteva zile de vârstă [Heard și colab., 1984]. Depistarea în masă a deficitului de biotinidază în Ungaria a început în 1989 la inițiativa directorului general de atunci al Institutului Național de Sănătate a sugarului și copilului, prof. Dr. Dezső Schuler. Ministerul Sănătății a făcut obligatoriu screening-ul neonatal în masă al bolii la nivel național în ambele centre de screening [Havass, 1991]. Screeningul pentru deficitul de biotinidază este împărțit în mod similar cu galactozemia. Dintre cele 51 de state membre din Statele Unite, 47 au screening obligatoriu obligatoriu în masă neonatală [Therrell și Adams, 2007]. În Europa, screening-ul a fost introdus în șase țări: Suedia, Germania, Elveția, Liechtenstein, Austria și Ungaria. Alte patru țări: Spania, Belgia, Italia și Turcia sunt fie în faza experimentală de stabilire a screening-ului, fie examinează doar anumite intervale (Figura 10.B) [Loeber, 2007]. Figura 10. Screening pentru galactozemie (A) și deficit de biotinidază (B) în Europa (pe baza statisticilor din 2004; Loeber, 2007) 32

Metode de măsurare [Beutler și Baluda, 1966]. Enzima GALT din proba de sânge inițiază o secvență de reacție enzimatică în amestecul de reacție, la sfârșitul căreia NADP este redus. GALT Gal-1-P + UDPG G-1-P + UDP-Gal fosfoglucomutază G-1-P G-6-P G-6-PDH G-6-P + NADP 6-PGA + NADPH 6-PGD 6- PGA + NADP R-5-P + NADPH Nivelul de NADPH format este proporțional cu activitatea enzimei GALT. În timpul evaluării, fluorescența a fost detectată folosind o lampă UV. 4.6. Diagnosticul diferențial în galactozemie Screeningul în masă detectează niveluri ridicate de galactoză/galactoză totală în toate formele de galactozemie. Măsurarea activității enzimei este disponibilă în Ungaria numai în cazul enzimei GALT, astfel încât diagnosticul diferențial precis al galactozemiei în Ungaria poate fi efectuat prin metode genetice moleculare (Figura 13). Figura 13. Organigrama diagnosticului diferențial al galactozemiei 43

Metode de pe discuri, apoi s-au efectuat alte reacții chimice până la reacția finală de culoare. A fost utilizată o placă de microtitrare în locul tuburilor și densitatea optică a fost măsurată prin ELISA (Fig. 14.B) [Schuler și colab., 2007]. Figura 14. Metode de screening pentru deficiența de biotinidază A: Metodă de testare cantitativă enzimatică Între 1989 și 2004 B: Metodă de testare cantitativă enzimatică Din 2004 Un computer conectat la un cititor a convertit imediat densitatea optică măsurată în activitate enzimatică procentuală, dând un rezultat cantitativ. La dezvoltarea metodologiei, a fost important ca densitatea optică citită la 545 nm să fie direct proporțională cu activitatea enzimatică a biotinidazei serice. Pentru a verifica acest lucru, au fost examinate densitățile optice ale probelor de sânge standard cu activitate enzimatică cunoscută și în creștere. Trasarea OD măsurată în funcție de procentul de activitate enzimatică a dat o linie liniară care a confirmat eficiența metodei (Fig. 15). Figura 15. Activitatea enzimei biotinidazei în funcție de densitatea optică 45

Metode Bioline Immomix fabricate de Roche au fost utilizate. Detectarea a fost efectuată pe un gel de agaroză 2% prin electroforeză pe gel. 4.15. Metode statistice Testul exact Fischer a fost utilizat pentru a compara frecvențele simptomelor clinice. În studiile genetice ale populației, testul χ 2 a fost utilizat pentru a compara frecvențele mutațiilor la diferite populații. Calculele au fost efectuate folosind software-ul GraphPad Prism (GraphPad Software, SUA). 54

Rezultate Număr de pacienți Mutație Alela 1 Mutație Alela 2 Vârstă * (an) Nu Simptome neonatale Simptome tardive 32 p.q188r p.e146d 25 Femelă D - 25% 33 p.q188r p.e146d 16 Bărbat NB 25% 34 p.k285n nd 4 Femei N 25% 35 p.k285n nd 4 Masculin N 25% 36 p.k285n p.n314d p.l218l 37 p.q188r p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 38 p.q188r p.n314d p.e340k 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 39 p.k285n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 40 p.k285n p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 41 p.p325l p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 42 p.m142k p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 43 nd p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 44 nd p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 45 nd p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A 46 nd p.n314d 5 UTR-119delGTCA IVS4nt-27G> C IVS5nt + 62G> A IVS5nt-24G> A GALT # activitate 60 Masculin nd - 50% 19 Feminin D - 25% 14 Masculin D - 25% 41 Masculin nd - 25% - Masculin E d 25% 4 Masculin N 25% 3 Feminin D 25% 4 Feminin D 25% 3 Feminin N 25% 3 Femei N 25% 2 Femei D 25% 61

Rezultate La un grup de pacienți, un promotor (c.-179a> g) și un polimorfism intron (IVS8nt-40C> T [c.1171-40c> t]) au fost găsiți în intronul 7. Figura 20. Imaginea de secvențiere homozigotă a unei noi mutații găsită în mutația genei GALK1 p.l263p (c.2430t> c), leucina> substituție de aminoacizi prolină În plus față de pacienți, am efectuat teste genetice moleculare pe doisprezece membri direcți ai familiei dintr-o familie dintre care erau purtători ai mutației p.p28t. Interesant este că această familie a purtat varianta Los Angeles a genei GALT pe ramura maternă. Au existat în total șapte purtători în familie pentru mutația p.n314d: p.l1818l, inclusiv îngrijitorul (III./1.) Cu deficit de galactokinază și mama (II./3.) Și bunicul matern (p. 3). 28tl) cu mutația p.p28t. I./3.) (Figura 21). Respectiv, un membru al familiei a fost homozigot pentru varianta Los Angeles (II./7). Figura 21. Arborele genealogic al unui pacient cu deficit de galactokinază; familia poartă mutația p.p28t în gena GALK1 și varianta Los Angeles a genei GALT (D1) 64

Rezultate Figura 22. Secvențierea heterozigotă a cinci noi mutații găsite în gena BTD A: mutația p.e46x (c.136g> t), acid glutamic> opriți înlocuirea codonului B: mutația p.t152p (c.454a> c), treonina> aminoacidul prolină înlocuire C: mutație p.r157c (c.469c> t), arginină> substituție aminoacid cisteină D: mutație p.n195s (c.584a> g), asparagină> substituție serină aminoacid E: mutație c.406 în cazul mutațiilor care determină scăderea activității enzimatice și, prin urmare, a bolii în plus, am găsit și două mutații silențioase: mutația p.l215l (c.645c> t) într-un caz, în timp ce p.c471c (c.1413t> c) non-amino mutația schimbului acid ar putea fi detectată în trei familii independente, pentru un total de șase indivizi. În plus, a fost detectată o altă mutație greșită care cauzează o formă severă de deficit de biotinidază la un purtător (29-01): p.t532m (c.1595c> t). În plus față de pacienți, un total de 132 de membri direcți ai familiei din treizeci și șase de familii au fost supuși analizei genetice moleculare, dintre care 95 s-au dovedit a fi purtători ai uneia dintre mutațiile cu deficit de biotinidază. 68

Rezultate 5.4.2. Genotipuri și simptome clinice ale pacienților cu deficit de biotinidază Formă severă de deficit de biotinidază în regiunea Ungariei de Vest (activitate relativă a enzimei BTD T 0,07 1% 17 I Sz 38-01 p.a82d nd 0,28 4% 19 - E 39-01 p. v199m p.r211c 0,50 7% 18 I, Sz E 56-01 c.406delc p.a171t p.d444h 0,36 5% 0,5 I Pacienți Mutație Mutație Biotactic Biotinidază Vârstă Neonatală Late Număr 1 alelă 2. alelă nmol/min/ml activ% (an) * simptome simptome 04-01 p.q456h p.d444h 1.63 23% 5 Sz E, Sz 09-01 p.q456h p.d444h 1.49 21% 4 Sz E, Sz 09-02 p.q456h p.d444h 1.35 19% 10 Sz E, Sz 13-01 p.q456h p.d444h 1,56 22% 15 I, Sz - 13-02 p. Q456h p.d444h 1,70 24% 12 - E, Sz, A 15-01 p.q456h p .d444h 1,49 21% 4 Sz Sz, H 69

Discuție Printre simptomele tardive ale galactozemiei s-au numărat problemele de vorbire (dispraxia verbală). Acidul glutamic în poziția 146 a proteinei GALT este caracterizat de un grad ridicat de conservatorism, cu acid glutamic în această poziție la majoritatea speciilor (Fig. 24A). Aproximativ aprox. Activitatea reziduală de 25% a enzimei GALT se datorează probabil substituțiilor conservatoare de aminoacizi: aminoacidul codificat de codonul 146 se schimbă în acid aspartic în loc de acid glutamic. Figura 24. Secvența aminoacizilor și conservatorismul proteinei GALT la diferite specii, p. Localizarea surselor de mutații E146D (A) și p.s297p (B): www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez Mutația p.s297p la poziția 297 a proteinei GALT determină o modificare a aminoacizilor serină/prolină. Mutația a fost detectată la un pacient născut cu șase ani înainte de debutul screeningului de masă neonatală pentru galactozemie (Tabelul 8, pacientul 27). Deși pacientul a prezentat toate simptomele galactozemiei clasice la nou-născuți (icter pronunțat, pierderea poftei de mâncare, scădere persistentă în greutate, niveluri anormale ale enzimelor hepatice 78

S-a discutat și despre schimbul de sânge la copil), totuși diagnosticul exact a fost pus doar la vârsta de patru luni. Pacientul a urmat o dietă de atunci. Prezintă toate simptomele complicațiilor cosmice din galactozemia clasică. La cinci luni, ea a observat cataracta bilaterală, care a fost operată mai întâi la vârsta de doi ani și apoi de încă patru ori. Astăzi poartă 10 ochelari dioptrii pe un ochi și 10 pe celălalt. Se luptă cu probleme severe de vorbire (dispraxie verbală): abia vorbește, vorbirea sa spontană este de neînțeles, articulația sa este foarte unsă. Au apărut anomalii ale funcției motorii (mișcare rigidă, tremor continuu al mâinii, zvâcniri). Comportamentul său se caracterizează prin labilitate emoțională, atacuri agresive, izbucniri de furie și depresie sunt frecvente. Pacientul este retardat mental (IQ = 52), își repetă stereotipurile, capacitatea de recunoaștere și observare a situației este inexactă, slabă. La acest pacient, a fost detectat un genotip heterozigot mixt de p.q188r/p.s297p în studiul genetic molecular. Analizele mutației și măsurătorile activității enzimei la membrii familiei au confirmat că mutația p.s297p a fost în formă heterozigotă.

Discutarea tremurând etc.). Datele noastre nu au diferit semnificativ de Wagoner și colab. cu toate acestea, rezultatele în Germania au fost semnificativ mai mici (37%) (Figura 25). Figura 25. Frecvența simptomelor clinice pe termen lung în formele severe de galactozemie clasică verde (A): date proprii; coloană galbenă (B): date de la Wagoner și colab., (1990); coloană roșie (C): Schweitzer și colab., (1993); numărul de deasupra graficului cu bare este frecvența (%) simptomului clinic examinat; numărul negru dintre paranteze este numărul pacienților studiați (n); numărul de culoare dintre paranteze este valoarea obținută prin testul exact al lui Fisher (p) o comparație a propriilor noastre date cu datele internaționale; culoare roșie: diferență semnificativă (p 0,05) Dintre pacienții cu galactozemie clasică tratați la Centrul de îngrijire metabolică din Budapesta, cel mai frecvent simptom clinic pe termen lung este problema vorbirii (88%). Dezvoltarea târzie a vorbirii, vocabularul mai slab și problemele articulare (dispraxia verbală) sunt frecvente [Webb și colab., 2003]. Comparând datele descrise pe baza literaturii cu datele noastre, diferite tulburări de vorbire au apărut semnificativ mai des în populația de pacienți din Ungaria de Vest decât în alte țări (Figura 25). 81