SZENT ISTVAN UNIVERSITY. DOCTORAT (doctorat) DETERMINARE, IDENTIFICARE ȘI ROLUL PROTOTONILOR ÎN MEDIUL UMAN. Rusă Erika.

DOCTORALUL UNIVERSITĂȚII SZENT ISTVÁN (doctorat) DETERMINAREA, IDENTIFICAREA ȘI ROLUL PROTOZONULUI ÎN MEDIUL UMAN Orosz Erika Gödöll 2013

Numele școlii doctorale: disciplină: Școala doctorală de științe ale mediului Șef de științe ale mediului: Dr. György Heltai, profesor, D.Sc. Universitatea Szent István MKK Institutul de Științe ale Mediului Departamentul de Chimie și Biochimie Supervizor: Dr. György Füleky, profesor, C.Sc. Universitatea Szent István MKK Institutul de Științe ale Mediului Departamentul de Știința Solului și Agrochimie Supervizor: Dr. Bayoumi Hamuda Hosam Profesor asociat, C.Sc. Universitatea din Óbuda RKK Institutul de Științe ale Mediului aprobarea șefului școlii (Dr. György Heltai) . aprobarea conducătorului (Dr. György Füleky) . aprobarea conducătorului școlii (Dr. Bayoumi Hamuda Hosam)

ARN rpm sp., Spp. Tm Stoc WB OMS acid ribonucleic rotund pe minut Specii Analiza punctului de topire stoc propriu care nu este identic sau nelegat de orice entitate juridică națională sau internațională recunoscută ca entitate juridică. Această tulpină este o probă selectată în laborator de Western-Blot Organizația Mondială a Sănătății. Probabilitatea se numește nivelul de semnificație al testului statistic (MANCZEL 1983, KEMÉNY și DEÁK 2000). Valorile statisticii testului se încadrează în intervalul de acceptare cu o probabilitate de 1 dacă ipoteza nulă este adevărată. Alternativ, intervalul de acceptare este acela în care valorile statisticii testului pot avea o probabilitate de 1 datorită fluctuațiilor aleatorii. 4

CUPRINS ABREVIERI ȘI SIMBOLURI ÎN DISERTARE. 3 1 INTRODUCERE ȘI OBIECTIVE. 7 1.1 Actualitatea și semnificația subiectului. 7 1.2 Obiective. 8 2 REVIZUIREA LITERATURII. 9 2.1 Evoluție. 9 2.2 Proliferarea protozoarelor. 11 2.3 Protecția împotriva protozoarelor. 12 2.4 Metode de diagnostic pentru protozoare. 12 2.4.1 Examinarea microscopică a protozoarelor. 12 2.4.2 Studiu de reproducere a protozoarelor. 13 2.4.3 Examinarea imunoserologică a protozoarelor. 14 2.4.4 Studiul izoenzimic al protozoarelor. 16 2.4.5 Studiul biologic molecular al protozoarelor. 17 2.5 Epidemiologie. 18 2.6 Determinarea și identificarea nivelului speciilor de protozoare. 19 2.6.1 Descrierea noilor specii de protozoare. 19 2.6.2 Genul Entamoeba. 20 2.6.3 Genul Acanthamoeba. 29 2.6.4 Genul Giardia. 32 3 MATERIAL ȘI METODĂ. 37 3.1 Eșantionare. 37 3.1.1 Entamoeba sp. originea probelor. 37 3.1.2 Acanthamoeba spp. originea probelor. 37 3.1.3 Originea probelor intestinale Giardia. 37 3.2 Izolarea și identificarea protozoarelor. 37 3.2.1 Determinarea microscopică a Entamoeba histolytica și Giardia intestinalis. 37 3.2.2 Acanthamoeba spp. determinare microscopică. 38 3.3 Medii de cultură. 38 3.3.1 Mediul Entamoeba histolytica. 38 3.3.2 Acanthamoeba spp. mediu. 40 5

1.2 Obiectiv Detectarea Entamoeba histolytica din substanțele testate prin metode clasice și moleculare (PCR) utilizând o parte specifică a genei 16S-rRNA codificată în genomul parazit din porumb și lucernă rhizosphera Acanthmoeba spp. Detectarea Acanthamoeba spp. Izolată din rhizosphera prin metode clasice și moderne. Secvențierea și identificarea speciilor Detectarea Giardia intestinalis din materialele testate prin PCR clasică imbricată utilizând o parte specifică a genei 18S-rRNA codificată în genomul parazit 8

numarul 1 foaie de calcul. Apariția protozoarelor patogene și facultative patogene în corpul uman. Balantidium 10

Nr. 2 foaie de calcul. Intestinul Entamoeba spp. caracteristici morfologice (sursa: http://cmr.asm.org/content/16/4/713.full.pdf+html) 2.6.2.1 Entamoeba spp. morfologia Entamoeba histolytica Specia E. histolytica a fost descrisă de Les în 1875 la Sankt Petersburg, Rusia și numită de Fritz Schaudinn în 1903 (SAKLATVALA 1993). Se hrănește cu fagocitoză, se mișcă cu ajutorul bărbie, se reproduce asexuat. Se cunosc două manifestări: trofozoitul în mișcare, hrănirea, reproducerea 12-17µm (Fig. 1) și chistul format dintr-un perete puternic din cauza factorilor de mediu nefavorabili 10 15 m (Fig. 1.B). 21

Entamoeba coli (Grassis, 1879) E. coli este apatogenă, a doua doar după E. histolytica/E. dispar. Se cunosc două manifestări: trofozoitul 20-40µm (Fig. 2.A) care se mișcă, se reproduce, se hrănește, separarea endo- și ectoplasmă nu este întotdeauna detectabilă. În plasma sa puteți vedea granule fagocitare, vacuole și semințe cu cromatină periferică în nucleele conținute într-un aranjament grosier, excentric. Mișcarea trofozoitului este foarte lentă, sofisticată (MILCH și JANKÓ 1990). Chistul este înconjurat de un perete puternic de 15 30 m (Fig. 2 B) în care numărul nucleelor este de obicei mai mare de patru, de obicei opt. Figura B 2. Entamoeba coli trophozoita (A) și cysta (B) Entamoeba hartmanni După cum sa menționat mai sus, sunt cunoscute și două manifestări: trophozoita în mișcare, hrănire, reproducere 10-15µm (Fig. 3.A) și chistul 7-10µm (Fig. 3). Fig. B). Este apatogen, complet inofensiv și nu provoacă boli chiar și la persoanele imunodeprimate. Figura B 3. Entamoeba hartmanni trophozoita (A) și cysta (B) 23

Jodamoeba bütchli (Prowazek, 1911) Trofozoitul colonic, apatogen 10-20µm (Fig. 4.A) care trăiește în colon, membrana miezului său vezicular este conectat la nucleul mare prin creste fine de cromatină. Mișcarea trofozoitului este de natură progresivă, de obicei cu un vânt ascuțit în plasmă, un vacuol care conține glicogen care devine maro închis cu soluția Lugol. Chistul are unul sau doi nuclei de 7-15µm (Fig. 4 B) și se poate vedea întotdeauna vacuolul glicogen mare, care devine maro închis cu soluție de Lugol (MILCH și JANKÓ 1990). Figura B 4. Jodamoeba bütchli trophozoita (A) și cysta (B) În figurile aparținând genului Enthamoeba (1A, B; 2A, B; 3A, B; 4A, B), speciile pot fi studiate pe site-ul CDC (am folosit cifre pentru că a reprezentat cele mai realiste rezultate, surse: http://en.wikipedia.org http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/intestinalamebae.htm). 24

2.6.2.2 Entamoeba spp. ciclul de viață Figura 5. Ciclul de viață Entamoeba (sursă: http://en.wikipedia.org) Entamoeba spp. surse de infecție: apă sau alimente contaminate cu fecale și mâini murdare (am folosit această figură 5 pentru că a reprezentat cele mai realiste rezultate). 2.6.2.3 Ciclul de viață al chisturilor ingerate de Entamoeba histolytica (HAQUE și colab. 2003) nu sunt deteriorate de acidul gastric, astfel încât intră cu ușurință în intestinul subțire, unde devin trofozoizi. Derivați cu conținutul intestinal, ajung la colon, unde se așează pe suprafața mucoasei, galactoza, cunoscută sub numele de adeziv pentru galactoză, leagă N-acetil-Dgalactozamina de lectină și apoi lizează celulele mucoasei, peretele intestinal, Este inițial edem și 25

abcese, urmate de formarea ulcerelor caracteristice profunde, în formă de sticlă, ca urmare a necrozei (moartea țesutului). Surse de infecție: contaminare cu scaun sau alimente Mâini murdare apă Figura 6. Ciclul de viață al Entamoeba histolytica (sursa: http://en.wikipedia.org) Amebiaza cauzată de E. histolytica este caracteristică în primul rând zonelor tropicale și mediteraneene (CAVALLO și GARRABÉ 2007, HERBINGER și colab. 2011), un protozon invaziv în corpul uman cauzează boli intestinale și extraintestinale care pun viața în pericol. În forma sa extra intestinală, poate ataca ficatul (HOFFNER și colab. 1999, ACUNA-SOTO și colab. 2000), plămânul și alte zone corporale, traversând bariera mucoasei intestinale (BADALAMENTI și colab. 1999). E. histolytica patogenă este cel mai frecvent introdusă în corpul uman de mâini nespălate, apă contaminată cu chisturi, fructe contaminate cu fecale umane sau contact sexual oral-anal (PHILLIPS și colab. 1981; QUINN și colab. 1981). 26

Potrivit unor cercetători, tulpinile patogene Enthamoeba histolytica apar doar în climatul tropical sau subtropical (CLARK și DIAMOND 1991, SILBERMAN și colab. 1999, DEBNATH și colab. 2012), în timp ce zonele temperate sunt apatogene E. dispar (VÁRNAI 1987, HUSTON și PETRI 1999). În Ungaria, acesta este adus în principal de turiști și imigranți din zone endemice (OROSZ și colab. 2012). Infecția are loc prin consumul de fructe, legume sau chisturi în băuturi contaminate cu fecale. (IDOWU ȘI ROWLAND 2006). În diareea acută, un pacient cu cărbune rulează multe chisturi (5x10 la fiecare 7 zile). 28