Analiza stării tamponului glutation redox în probe biologice - aspecte fiziologice și patologice

Una dintre cele mai importante componente ale homeostaziei redox în celule este glutationul. Un raport adecvat dintre perechea redox tiol/disulfură ajută la regenerarea altor antioxidanți, protejează împotriva stresului oxidativ, iar prezența sa este o condiție esențială pentru formarea punților disulfură intracaten și inter-lanț în proteine și, prin urmare, plierea proteinelor în lumenul endoplasmatic. reticul (ER). Raportul dintre glutationul redus (GSH) și cel oxidat (GSSG) depinde, de asemenea, de tipul probei (țesut, sânge, ser, cultură celulară etc.), precum și de starea organului și redox. Raportul celular variază foarte mult. Raportul citosolic variază de obicei între 30: 1 și 100: 1, dar datorită homeostaziei redox specifice din lumenul ER, raportul este mult mai mic, variind de la 1: 1 la 3: 1. Proporția corectă de perechi redox este esențială pentru buna funcționare a celulelor, astfel încât cuantificarea și proporția precise sunt esențiale în cercetarea biochimică.

Provocarea analizei este, pe de o parte, cantitatea mică de eșantion disponibil și, pe de altă parte, instabilitatea substanțelor care urmează să fie măsurate. Este o metodă de măsurare general acceptată pentru a cuantifica GSSG nu direct, ci indirect. Cantitatea totală de GSSG este convertită în GSH și cantitatea de GSSG este dedusă din creșterea nivelurilor GSH. Scopul nostru a fost să dezvoltăm o metodă în care să putem determina ambii membri ai perechii redox direct și simultan. Pentru aceasta a fost aleasă metoda HPLC-MS/MS. Având în vedere că sensibilitatea acestor dispozitive se poate schimba în timpul măsurării, în special în cazul matricilor biologice complexe, am avut nevoie, de asemenea, de un standard intern selectat corespunzător. S-a ales metil GSH în acest scop.

În primul rând, metoda a fost verificată prin modificarea raportului GSH/GSSG prin metode chimice (oxidarea hidroperoxidului de terț-butil și reducerea ditiotreitolului) și testarea dacă rezultatele obținute prin metoda noastră îndeplinesc cerințele echilibrului materialului (una dintre substanțe dacă rata de pierdere în greutate corespunde ratei de creștere a celeilalte substanțe). Acest control a fost, de asemenea, efectuat pe probe de microsomi și celule.

Deoarece concentrațiile libere de acizi grași liberi pot provoca stres oxidativ semnificativ în celule (lipotoxicitate), extindem studiile noastre la probele tratate cu acizi grași diferiți, unde scopul este de a monitoriza modificările stării redutiei glutationului.