Ecran dgp Pentru diagnostic in vitro se utilizează complexitatea CLIA: mare

Recomandați documente

Ecran QUANTA Lite ™ h-tTG/DGP

Pentru diagnostic in vitro, utilizați complexitatea CLIA: mare

Ecranul QUANTA LiteTM h-tTG/DGP este un test imunosorbent legat de enzime (ELISA) pentru detectarea semicantitativă a anticorpilor IgA și IgG împotriva peptidelor sintetice derivate din gliadină (DGP) și împotriva transglutaminazei țesutului uman (htTG) la om ser. Prezența acestor anticorpi poate fi utilizată împreună cu rezultatele clinice și alte teste de laborator pentru diagnosticarea bolii celiace cu deficit de IgA și deficit de IgA.

Principiul metodei Peptidele gliadinei deamidate sintetice purificate (DGP sau gliadina II) se leagă de celulele plăcii de microtitrare din polistiren în condiții care păstrează antigenul în forma sa nativă. Probele de control pre-diluate și probele de ser ale pacientului diluate sunt administrate la diferite celule, permițând oricărui peptid de gliadină și/sau anticorpi h-tTG IgA sau IgG prezenți să se lege de antigenul imobilizat. Proba nelegată este spălată și se adaugă conjugat anti-IgG și IgA anti-uman marcat cu enzimă la fiecare celulă. O a doua incubație permite IgA și IgG anti-uman marcate cu enzimă să se lege de orice anticorp din proba pacientului care s-a legat anterior de celulă. După spălarea tuturor candidaților enzimei nelegate cu IgA și IgG anti-umane, activitatea enzimatică reziduală este determinată prin adăugarea unui substrat cromogen și măsurarea intensității culorii rezultate. Testul poate fi evaluat spectrofotometric prin măsurarea intensității culorii formate în celule și compararea acestuia cu controalele. 1

Reactivi 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Avertismente 1. 2.

Precauții 1. 2. 3. 4.

poate duce la valori de absorbanță inacceptabil de scăzute. Este important să respectați strict instrucțiunile de manipulare a conjugatului HRP pentru a preveni astfel de probleme. Curățarea necorespunzătoare a dispozitivelor și instrumentelor poate contamina chimic conjugatul HRP. Reziduurile substanțelor chimice de laborator utilizate în mod obișnuit, cum ar fi formalina, înălbitorul, alcoolul sau detergenții determină degradarea conjugatului HRP în timp. După utilizarea detergenților chimici sau a dezinfectanților, echipamentele și ustensilele trebuie clătite bine.

Condiții de depozitare 1. 2. 3.

Păstrați toți reactivii kitului la 2-8 ° C. Nu poate fi înghețat. Reactivii sunt stabili în termenul de expirare indicat atunci când sunt manipulați și depozitați conform instrucțiunilor. Tuburile de microtitrare neutilizate acoperite cu antigen trebuie păstrate cu desicantul într-o pungă din folie și sigilate la 2-8 ° C. Tamponul de spălare diluat este stabil timp de 1 săptămână la 2-8 ° C.

Colectarea și manipularea probelor Această procedură este potrivită pentru testarea probelor de ser. Nu se recomandă adăugarea azidei sau a altor conservanți la probele care urmează a fi testate, deoarece acestea pot distorsiona rezultatele măsurătorilor. Probele care conțin precipitate sau particule solide contaminate microbiologic, tratate termic sau vizibile nu trebuie utilizate. Evitați utilizarea de probe foarte hemolizate sau lipemice. După recoltare, serul trebuie separat de cheag. „Documentul CLSI (NCCLS) H18-A3” recomandă următoarele condiții pentru depozitarea eșantioanelor: 1) Nu păstrați eșantioanele la temperatura camerei mai mult de 8 ore. 2) Dacă testul nu poate fi efectuat în decurs de 8 ore, păstrați probele la frigider la 2-8 ° C. 3) Dacă testul nu poate fi efectuat în 48 de ore sau eșantioanele trebuie transportate, congelați și depozitați probele la -20 ° C sau mai puțin. Probele congelate trebuie amestecate bine după decongelare și înainte de testare

Efectuarea testului Materialele disponibile în kit 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Placă de microtitrare ELISA Screen h-tTG/DGP (12-1 x 8 celule) cu cadru suport 1,2 ml control ELISA negativ prediluat (Control negativ ELISA) 1,2 ml Ecran h-tTG/DGP prediluat Control ELISA moderat pozitiv (h- tTG/DGP Screen ELISA Low Positive) 1,2 ml h-tTG/DGP prediluat Screen ELISA High Positive (h-tTG/DGP Screen ELISA High Positive) 50 ml HRP Eșantion diluant 25 ml HRP Concentrat de spălare concentrat), concentrație de 40 de ori 10 ml HRP h- tTG/DGP IgG/IgA (HRP h-tTG/DGP IgG/IgA), (capră), IgG anti-uman și IgA 10 ml TMB crom 10 ml HRP Stop Soluție 0,344 M acid sulfuric

Materiale suplimentare neincluse în kit Micropipete pentru 5, 100, 200-300 și 500 mL Măsurători Sfaturi de unică folosință Micropipete Tuburi de testare pentru diluarea probelor pacientului cu un volum de 4 mL Apă distilată sau deionizată 1 L recipient de HRP Wash Concentrate Microtiter Reader capabil să măsoare DO la 450 nm (sau 620 nm la două lungimi de undă)

Metoda Înainte de a începe: 1. 2.

Așteptați ca probele și reactivii să atingă temperatura camerei (20-26oC) și amestecați bine. Diluați HRP Wash Concentrate 1:40 adăugând conținutul sticlei HRP Wash Concentrate la 975 ml de apă distilată sau deionizată. Dacă nu se folosește întreaga placă în același timp, se poate dilua o cantitate mai mică: pentru fiecare 16 celule care trebuie utilizate, se adaugă 2,0 ml de concentrat la 78 ml de apă distilată sau deionizată. Tamponul diluat este stabil timp de 1 săptămână atunci când este depozitat la 2-8 ° C. Efectuați o diluție de 1: 101 pentru fiecare probă de pacient, după cum urmează: adăugați 5 pl de probă la 500 pl de diluant de probă HRP. Probele diluate trebuie utilizate în decurs de 8 ore. NU DILUAȚI ecranul h-tTG/DGP Control ELISA Moderate Positive Control, ecranul h-tTG/DGP Control ELISA High Positive Control și controlul negativ ELISA. Pentru a determina prezența sau absența anticorpilor h-tTG/DGP IgA și/sau IgG în oricare dintre unități, utilizați două celule pentru a măsura fiecare dintre cele trei controale și una sau două celule pentru a măsura fiecare probă de pacient. Se recomandă determinarea probelor duplicate din probele pacienților.

Efectuarea testului 1.

Controlul calității 1. 2. 3.

Calculul rezultatelor Mai întâi, determinați media valorilor OD pentru fiecare replică. Reactivitatea fiecărei probe poate fi apoi calculată prin împărțirea OD medie a probei la OD medie a h-tTG/DGP Screen ELISA control moderat pozitiv. Înmulțiți rezultatul cu numărul de unități de pe ecranul h-tTG/DGP ELISA Etichetă de control pozitiv moderat ELISA.

Eșantion OD Valoare eșantion = ——————————————————— x h-tTG/DGP Ecran ELISA moderat pozitiv (unități) h-tTG/DGP Ecran ELISA OD moderat pozitiv (unități) A există o relație neliniară între reactivitate și cantitatea de anticorpi din probă. În timp ce creșterea și scăderea concentrației de anticorpi a pacientului se reflectă în creșterea și scăderea reactivității asociate, schimbarea nu va fi proporțională (adică, dublarea concentrației, dar nu dublarea reactivității). Dacă este necesară o determinare mai precisă a concentrației de anticorpi a pacientului, seria de diluție a probei pacientului trebuie testată și trebuie luată în considerare ultima diluție care este încă pozitivă în probă.

Interpretarea rezultatelor Fiecare laborator ar trebui să își determine propriile intervale de referință, utilizând tehnicile, controalele, dispozitivele utilizate în prezent și într-o manieră specifică populației de pacienți studiați, în conformitate cu propriile proceduri. Clasificarea eșantionului poate fi negativă sau pozitivă în conformitate cu tabelul de mai jos. Negativ Pozitiv 1. 2. 3.

Un rezultat pozitiv indică prezența peptidei gliadinei și/sau h-tTG IgG și/sau anticorpi IgA în probă și crește posibilitatea unor enteropatii sensibile la gluten, cum ar fi boala celiacă. Un rezultat negativ indică faptul că pacientul nu are peptidă gliadină și/sau anticorpi h-tTG IgG sau IgA sau concentrația lor nu atinge pragul de diagnostic al testului. Se recomandă ca evaluarea emisă de laborator să includă următoarea afirmație: „Următoarele rezultate au fost obținute folosind ecranul INOVA QUANTA LiteTM h-tTG/DGP. Valorile peptidei Gliadin și tTG IgG/IgA obținute din testele altor producători pot fi diferite și nu sunt interschimbabile. Cantitatea de valoare a anticorpilor raportată nu poate fi comparată cu un titlu al punctului final. "

Limitări ale metodei 1. 2. 3.

Valorile așteptate Intervalul de referință 496 persoane selectate aleatoriu, asimptomatice, sănătoase din Statele Unite au fost testate pentru anticorpi h-tTG/DGP. Dintre aceștia, 299 de donatori au variat între 14 și 78 de ani, cu 150 de bărbați și 149 de femei. Au existat 7 eșantioane (1,4%) peste limita de 20 de unități. 5 probe au fost pozitive cu următoarele valori: 20,2, 22,1, 23,4, 29,2 și 36,5 unități. Celelalte două eșantioane pozitive au fost 46,1 și respectiv 39,0 unități, probabil că acestea au fost probe adevărate celiace, datorită faptului că rezultatele lor Ig-h-tTG au fost de 57,2 și respectiv 72,4 unități. Abaterea standard a probelor negative a fost doar de 3,8 unități. Media a fost de trei ori abaterea standard în timpul limitei de 20 de unități.

Caracteristici specifice de performanță Compararea cu un produs aprobat

99 de probe din patru laboratoare de referință celiacă au fost testate pe ecranul QUANTA Lite ™ Celiac DGP, QUANTA Lite ™ h-tTG IgA, QUANTA Lite ™ h-tTG IgG și QUANTA Lite ™ htTG/DGP Screen ELISA. Aceste rezultate, precum și cele ale eșantionului normal 496, sunt prezentate în Figura 5 de mai jos

Un eșantion a fost considerat pozitiv pe baza utilizării produsului acceptat dacă s-a constatat că este pozitiv pe unul dintre cele trei produse acceptate (rezultatul nu ar putea fi pozitiv pe toate cele trei dispozitive). Un eșantion a fost considerat negativ pe baza utilizării produsului acceptat dacă a dat un rezultat negativ pe toate cele trei dispozitive. N = 595 Ecran DGP celiac și/sau h-tTG Ecran pozitiv negativ Ecran h-tTG/DGP pozitiv 48 4 * Negativ 7 ** 536 Procentaj pozitiv Potrivire: Procentaj negativ Potrivire: Potrivire generală:

48/55 (87,3%), interval de încredere 95%: 94,5 până la 94,7% 536/540 (99,3%), interval de încredere 95%: 94,5 până la 97,4% 584/595 (98,2%), interval de încredere 95%: 96,7 până la 99,1 %

* Din cele 4 eșantioane care s-au dovedit a fi h-tTG/DGP pozitive la ecran, totuși ambele truse h-tTG au fost negative, 3 au fost din testul normal. Al patrulea pacient a fost un pacient celiac cu o dietă fără gluten, 22,1 unități. ** Din cele 7 eșantioane care s-au dovedit a fi h-tTG/DGP pozitive la ecran, dar negative fie pentru celiacă DGP, fie pentru kitul h-tTG, 5 au fost din testul normal. Restul a fost un pacient celiac cu o dietă fără gluten, cu o valoare de 21,5 unități la testul IgA h-tTG. Cealaltă probă a fost o rudă de gradul I, cu 20,2 unități la testul celiac DGP Screen Screen.

Studii clinice Eșantioane definite clinic, cum ar fi pacienții celiaci netratați (139 pacienți pediatrici), pacienții celiaci, pacienții celiaci cu deficit de IgA, pacienții celiaci latenți, pacienții celiaci încăpățânați, pacienții celiaci care au o dietă fără gluten, pacienții celiaci de gradul I, probele pacienților celiaci de la pacienți non-celiaci au fost testați intern și în studii clinice externe pe ecranul QUANTA LiteTM h-tTG/DGP. Un rezumat al rezultatelor probelor definite clinic, precum și al probelor în intervalul normal menționat mai sus este prezentat mai jos. Grup de pacienți # h-tTG/DGP pozitiv% Boală celiacă netratată (copil) 185 (139) 183 (139) 99% (100%) Boală celiacă, deficit de IgA 5 5 100% Boală celiacă, latentă 11 10 * 91% Boală celiacă, încăpățânat 9 8 * * 89% la dieta celiacă, fără gluten 120 34 28% Rudele de gradul I 18 2 11% Controalele pacientului 76 8 10,5% Normal 914 20 *** 2,2% * Din cei 11 pacienți cu celiaci latenți, 8 au fost tTG IgA pozitive și 9 EMA pozitive ** Din cei 9 pacienți cu boală celiacă persistentă raportate, niciunul nu a fost pozitiv EMA și doar 2 (22%) au fost tTG pozitivi Dintre cei 20 pozitivi care au fost pozitivi pentru h-tTG individual și DGP ELISA, 2 au fost tTG pozitive pentru testul RIA în fază lichidă este. Performanța h-tTG/DGP Screen ELISA în diagnosticul bolii celiace

Pozitiv Boala celiacă netratată, copil, IgA deficient, latent sau încăpățânat

Diagnostic * Negativ (rude de gradul I, controale ale pacienților și controale sănătoase) 30.978.100

QUANTA Positive 207 LITE ™ Negative 3 h-tTG/DGP Total 210 Screen * Exclude pacienții celiaci care urmează 120 de diete fără gluten.

Sensibilitate: 98,6% (207/210), 95% interval de încredere: 94,5 până la 99,7% Specificitate: 97,0% (978/1008), 95% interval de încredere (CI): 94,5 până la 98,0% Sensibilitate - Sensibilitatea celiacă totală a fost calculată din punerea în comun a rezultatelor de la toți pacienții celiaci (cu excepția celor care deja au urmat o dietă fără gluten). Din totalul de 210 boli celiace, 207 (adică 98,6%) au fost pozitive. Specificitate - Specificitatea a fost calculată din gruparea rezultatelor de la 914 persoane normale, 76 pacienți de control și 18 rude de gradul I. Acest grup conținea un total de 1008 probe. Dintre acestea, 30 de probe au fost pozitive cu o specificitate de 97,0%.

Reactivitate încrucișată Pentru a evalua problemele așteptate cu o posibilă reactivitate încrucișată cu alți autoanticorpi, au fost testate diferite probe pozitive de autoanticorpi cu titlu ridicat cu kitul de ecran QUANTA Lite ™ h-tTG/DGP. Au fost testate în total 83 de probe. Mai multe probe au fost martori extrem de pozitivi pentru alte truse de testare a anticorpilor INOVA QUANTA LiteTM. Probele includ Actină (4), cromatină (7), ADNd (4), M2 (4), 6

MPO (5), Centromer (7), CCP3 (5), GBM (9), Ribo P (4), RF IgG (4), SS-B (4), RNP (4), Scl-70 (4), Jo-1 (4), Sm (4), SS-A (6) și TPO (4). Media celor 83 de probe a fost de 4,51 unități. Toate probele au fost negative pe ecranul QUANTA LiteTM h-tTG/DGP. Media a fost de 4,4 ori abaterea standard în timpul limitei de 20 de unități.

Precizia intra - laborator

Performanța intra-test a ecranului QUANTA Lite ™ h-tTG/DGP a fost evaluată prin retestarea a 12 probe, de 5 ori fiecare. Acest test a fost efectuat de un singur operator în INOVA Diagnostics, într-un set de doză unică. Rezultatele sunt prezentate în tabelul de mai jos. QUANTA Lite ™ h-tTG/DGP Screen ELISA performanță intra-test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 medie 113,3 62,9 41,3 35,7 22,1 21,6 18,7 19,0 7,9 SD 1,3 1,1 0,7 0,6 0,4 0,3 0,2 0,9 1,0 CV% 1,2 1,7 1,7 1,7 1,1 1,2 1, 2 4,5 12,4

În studiul de schimbare inter-test, un grup de 12 probe a fost testat în duplicat timp de 3 zile, de două ori pe zi (o dată dimineața și o dată după-amiaza). Acest test a fost efectuat de un singur operator în INOVA Diagnostics, într-un set de doză unică. Rezultatele studiului sunt rezumate în tabelul de mai jos. QUANTA Lite ™ h-tTG/DGP Screen ELISA performanță inter-test ABCDEFGHIJKL medie 66,6 117,1 46,4 22,4 36,8 22,9 16,1 17,1 7,2 6,6 6,6 9, 7 SD 2,1 3,6 2,4 2,3 2,2 1,1 1,5 0,3 0,7 1,4 1,8 CV% 3,2 3,0 5,2 5 .3 9,0 9,5 6,9 8,7 4,4 11,2 21,3 18,8 Diferența de doză Studiul diferenței de doză a fost realizat în INOVA Diagnostics folosind trei seturi de tratament folosind trei seturi de doză diferite, în trei zile diferite. Rezultatele studiului sunt rezumate în tabelul de mai jos. Exemplu de control puternic pozitiv pozitiv 1 pozitiv 2 pozitiv 3 pozitiv 4 pozitiv 5 pozitiv 6 pozitiv 7 pozitiv 8 test gol Control negativ negativ 1 negativ 2 negativ 3 negativ 4

Porții 1 88,23 53,22 104,68 44,16 27,31 30,63 22,23 40,39 114,13 1,66 1,71 6,64 6,44 8,55 8,55

Porții 2 77,39 57,92 118,56 43,85 21,24 36,85 23,23 47,32 121,18 1,66 1,54 5,64 6,61 8,94 11,90

Doză 3 CV medie standard% 98,90 88,17 10,76 12,20 58,94 56,69 3,05 5,38 110,69 111,31 6,96 6,25 44,83 44,28 0 0,50 1,13 29,48 26,01 4,27 16,42 37,25 34,91 3,71 10,63 21,74 22,40 0,76 3,39 46,74 44,82 3,84 8,58 114,36 116,56 1,74 0,21 12,17 7,43 6,57 0,90 13, 65 8,63 7,23 1,22 16,86 9,19 8,89 0,32 3,63 12,45 10,97 2,11 19,25

Referințe 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25.