Clasificarea genomică comparativă a cancerului de ficat uman

Recomandați documente

Clasificarea genomică comparativă a cancerului hepatic uman Disertație de doctorat

Dr. Pál Kaposi-Novák Semmelweis University Doctoral School of Pathology

Supervizor: dr. András Kiss, conferențiar universitar, doctorand, candidat la medicină Judecători oficiali: dr. Gábor Horváth, dr. Dr. Miklós Mózes, dr. Președinte al comitetului de examinare: membrii comitetului de examinare:

Prof. dr. Péter Sótonyi Dr. Gabriella Lengyel, dr. Dr. Dr. Károly Simon, dr. Dr.

Fondul molecular al hepatocarcinogenezei

3.1.1 Epidemiologia cancerului hepatic primar 8 3.1.2 Rolul patogenetic al infecției virale cronice 12 3.1.3 Cele mai frecvente anomalii genetice în cancerele hepatice 15 3.1.4 Cele mai importante mecanisme de reglare moleculară implicate în dezvoltarea carcinoamelor hepatice. 22

Analiza transcripțională Fundamentul tehnologic al analizei expresiei bazate pe microarrays Analiza statistică a datelor microarray

Rolul genomicii funcționale în patogeneza cancerului hepatic uman

la examen

Analiza expresiei genelor în hepatita cronică Anomalii ale expresiei genei observate în carcinoamele hepatice Analize genomice comparative

Fixarea formalinei ARN fixarea ulterioară și acetonă Examen histologic

Probele de carcinom hepatocelular uman

5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4

Colectarea și prelucrarea specimenelor edometriale umane

Modele de șoarece transgenic Myc și Myc/Tgfα Dezvoltarea modelului animal knock-out condiționat c-Met Izolarea și tratamentul celulelor hepatice primare de șoarece în cultura celulară

Alte metode experimentale Microdisecție laser Colorare imunohistochimică Analiză cantitativă în timp real RT-PCR Amplificare liniară a ARN-ului

Analiza transcripțională bazată pe microarray Etichetarea eșantioanelor de ARN ale platformelor de microarrays utilizate și hibridizarea microarraysului Analiza statistică a datelor de expresie

Examinarea integrității ARN-ului recuperabil și a morfologiei țesuturilor este fixă

la exemplarele patologice încorporate în parafină

6.2 Dezvoltarea unei noi metode de amplificare a ARN-ului liniar în două runde pentru sinteza probelor de ARN de sens 6.3

Aplicarea amplificării T7T3 la probe microdisecate cu laser pentru exprimare

Identificarea genelor țintă HGF/c-Met în hepatocitele primare de șoarece

Analiza genomică comparativă a probelor umane de HCC

Rolul activării căii c-Met în reglarea motilității celulare Rolul căii c-Met în reglarea homeostaziei oxidative intracelulare

Identificarea modelului de expresie c-Met în carcinoamele hepatice umane Corelația modelului de expresie activat c-Met cu fenotipul tumorii Stabilirea unui model de prognostic bazat pe modelul de expresie indus de c-Met

Efectul fixării țesuturilor de rutină asupra analizei moleculare a probelor patologice

Utilizarea amplificării liniare a ARN-ului T7T3 în leziunile hepatice

pentru analiza transcripțională 7.3

Utilizarea modelului de expresie genică activat de calea c-MET a

clasificarea moleculară a tumorilor hepatice

Lista tabelelor și figurilor

Lista publicațiilor proprii

Publicații proprii legate de disertație.

Publicații proprii independente de disertație.

138 Eroare! Marcajul nu există.

activator al plasminogenului urokinazei

proteină polenoză adenomatoidă

hibridizare genomică comparativă

factor de transcripție asociat retinoblastomului

factor de creștere epidermică

receptorul factorului de creștere epidermic

kinază activată cu semnal extra celular

etichetă de secvență exprimată

locus genomic fragil

glicogen sintază kinază

antigen de suprafață al hepatitei B

virusul hepatitei B.

virusul hepatitei C

factorul de creștere a hepatocitelor

telomeraza umană transcriptaza inversă

factor de creștere asemănător insulinei

receptor al factorului de creștere asemănător insulinei

substrat receptor al insulinei

analiza discriminatorului liniar

pierderea heterozigoza

lăsați validarea încrucișată

kinaza activată cu mitogen

proporționalitate multidimensională

kinaza kinază activată mitogenă

microarray-ul are nevoie de informații minime pentru a comunica experimentele

Proteina de reparare a nepotrivirii ADN-ului

nepotrivire - sonda nucleotidică

ficat gras nealcoolic

steatohepatită nealcoolică

Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie

cel mai apropiat vecin

cel mai apropiat vecin 3

factor de creștere derivat din trombocite

potrivire perfectă (sondă nucleotidică)

receptorul retinoic beta

reacție în lanț a transcripției polimerazei complementare

analiza în serie a expresiei genice (snaliza în serie a expresiei genice)

un polimorfism care afectează nucleotidele

harta auto-organizatoare

suporta masina vectoriala

transformând factorul de creștere alfa

transformarea factorului de creștere beta

receptorul hormonului tiroidian alfa

receptorul hormonului tiroidian beta

inhibitor al metaloproteinazei tisulare

factor de necroză tumorală alfa

factorul de creștere endotelial vascular

virusul hepatitei marmotei

familie de integrare MMTV de tip fără aripi

modificarea pragului de detectare

Fondul molecular al hepatocarcinogenezei

Epidemiologia cancerului hepatic primar Carcinom hepatocelular uman al ficatului

a îmbunătățit semnificativ supraviețuirea asimptomatică a pacienților cu boală hepatică avansată (20). Cu toate acestea, grupul de pacienți din stadiul intermediar care beneficiază de terapie clinică (50%) este departe de a fi omogen. Llovet și colab. La 102 pacienți HCC cirotici tratați non-chirurgical, au fost analizate evoluția naturală a bolii și distribuția factorilor cu semnificație prognostică independentă (21). Pe baza rezultatelor lor, pacienții cu HCC pot fi împărțiți în cel puțin două subgrupuri pe baza prognosticului lor. Supraviețuirea la 1, 2 și 3 ani a pacienților fără simptome clinice (stadiul 0) - 80%, 65% și 50% - a fost semnificativ mai bună decât cea a pacienților cu cel puțin un simptom clinic (sindrom constituțional, invazie vasculară, dispersie extrahepatică). ”29%, 16% și 8% observate în grupul din stadiul 1” (Figura 1).

Figura 1: Supraviețuirea naturală a carcinoamelor hepatice. Supraviețuirea naturală netratată a pacienților cu HCC în diferite stadii ale bolii. Bazat pe Llovet și Bruix (21).

Rolul patogenetic al infecției virale cronice După cum sa menționat mai sus, infecția cronică a virusului hepatitei B și C în

cel mai important factor etiologic în dezvoltarea cancerului hepatic (4). Prin urmare, este necesar să se descrie mai detaliat efectul lor patologic. Pentru a înțelege procesul de hepatocarcinogeneză, este necesar să se descifreze ce elemente ale infecției virale duc la formarea carcinomului și în ce moment procesul tumorigenezei devine independent de factorii virali. 3.1.2.1

Virusul hepatitei B.

are ca rezultat formarea fusurilor mitotice (47). Secvențierea transportorului nuclear Crm1 duce la divizarea celulară prin acumularea de proteine NfκB și mdm2 în nucleu (48). HBxAg este, de asemenea, capabil să modifice modelul de metilare

prin hipermetilarea sa (49). Pe lângă HBxAg, alte proteine virale ale VHB au și efecte oncogene directe sau indirecte. Șoarecii transgenici care supraexprimă proteina plicului HBV L au dezvoltat carcinoame hepatice (50). Pe baza patomecanismului presupus, efectul citotoxic al proteinei L și recurența proliferării regenerative ulterioare singure sunt suficiente pentru a iniția formarea tumorii. În plus, proteinele de acoperire L și M, atunci când sunt acumulate în citoplasmă, provoacă stres oxidativ și metabolic, care poate fi direct mutagen (51). 3.1.2.2

Virusul hepatitei C.

Infecția cronică cu virusul hepatitei C este unul dintre factorii de risc majori pentru cancerul hepatic atât în țările occidentale, cât și în Japonia (52). La nivel mondial, din cei 170 de milioane de persoane seropozitive ale VHC, aproximativ 132 de milioane suferă de infecții cronice. Șansele de a dezvolta HCC la purtătorii VHC cresc de 17 ori, iar cancerul hepatic se dezvoltă în cele din urmă la 2-7% dintre pacienți. Infecția cu hepatită C reprezintă 26-76% din cazurile de HCC detectate în Europa și 80-90% din cazuri în Japonia (53). Virusul hepatitei C aparține familiei virusurilor ARN flaviviridae. Deoarece nu conține enzima transcriptază inversă, spre deosebire de virusul hepatitei B, nu se integrează în stocul genetic al celulei infectate. Proteazele virale (NS2-NS3) scindează diferite antigene virale (nucleu, E1-E2, P7, NS2-NS3, NS4a - b, NS5a - b) din poliproteina transcrisă din genomul ARN VHC (54). Proliferarea virionului VHC poate fi detectată și în cazurile de cancer hepatic (55). Replicarea genomului viral

ca rezultat, virusul este prezent simultan sub forma diferitelor variante. Dintre aceste variante, tipurile rezistente la răspunsul imun al gazdei au un avantaj selectiv și contribuie la infecția permanentă și la moartea celulelor hepatice.

stresul metabolic semnificativ apare în timpul replicării virale în reticul (ER). Aceasta inhibă inițial sinteza proteinelor și, în cele din urmă, caspaza 12

poate duce și la moartea celulară prin activarea acesteia. Stresul ER și stresul său oxidativ asociat pot duce la transformarea malignă prin activarea căii kinazei JUNK/p38 și, parțial, prin genotoxicitate directă (56). Unele dintre proteinele codificate de virusul VHC au, de asemenea, efecte cancerigene directe.

La șoarecii transgenici, antigenul de bază al VHC este supraexprimat pentru prima dată

a dus la dezvoltarea denomurilor hepatice și ulterior a carcinoamelor hepatice (57). Proteina de bază este capabilă să activeze expresia mai multor gene, inclusiv oncogenei c-myc, rezultând proliferarea anormală a celulelor. Nucleul VHC activează factorul de transcripție anti-apoptotic Nf-κB. Nucleul VHC inhibă, de asemenea, moartea celulară programată prin interacțiunea cu receptorul TNFα. Acest lucru are ca rezultat supraviețuirea celulelor infectate și promovează dezvoltarea infecției cronice (58). Efectul oncogen direct al proteinei HCV NS5a este exercitat prin modificarea profilului de expresie genică al celulei gazdă (59). NS5a inhibă răspunsul antiviral indus de interferon în celulele NIH 3T3 și apoptoza indusă de moleculele de ARN dublu catenar (60). Supraexprimarea proteinelor nestructurale NS3 și NS5a din celulele fibroblaste a promovat diviziunea celulară neaderentă și a contribuit, de asemenea, la dezvoltarea tumorilor la șoarecii nud imunosupresați (59). Transfecția stabilă a întregului transcript HCV în celulele HepG2, la rândul său, stimulează diviziunea celulară și supraviețuirea celulară (61). Pe baza tuturor acestora, putem presupune că VHC își exercită efectul cancerigen, cel puțin parțial, prin activarea directă a căilor oncogene.

Cele mai frecvente anomalii genetice în cancerul de ficat Este bine cunoscut faptul că dezvoltarea tumorilor maligne

acumularea secvențială a alterărilor genetice care afectează proliferarea celulară și genele reglatoare ale morții celulare. Vogelstein și colab. cercetarea noastră relevă, de asemenea, că sunt necesare defecte în cel puțin patru gene reglatoare pentru conversia completă malignă (62). În consecință, dezvoltarea tumorilor este adesea precedată de o perioadă lungă de incubație și de diferite stadii ale leziunilor pre-neoplazice. Un studiu mai detaliat al fundalului genetic al carcinoamelor hepatocelulare și al istoriei acestora a fost posibil prin tehnici PCR microsatelite (MSA) și tehnici de hibridizare comparativă (CGH) introduse în anii 1990. În prezent, genotiparea SNP și

Figura 2: Frecvența crescândă a anomaliilor genetice în timpul progresiei HCC. Acesta demonstrează o creștere liniară a frecvenței expresiei telomerazei, metilarea promotorului, instabilitatea microsateliților și pierderea alelelor în etapele succesive ale hepatocarcinogenezei. Bazat pe Thorgeirsson și Grisham. 3.1.3.1

Dezechilibru alelic și instabilitate microsatelit

Repetările scurte în tandem de 2-6 bp în lungime universal găsite în genom se numesc microsateliți. Apariția și lungimea lor prezintă polimorfism semnificativ în rândul indivizilor și, prin urmare, sunt potrivite pentru a distinge alelele individuale cu rezoluție mare. Fiecare cromozom conține, în medie, aproximativ 10000–15000 markeri unici de microsateliți (66). Localizarea repetărilor polimorfe este bine cunoscută și majoritatea oamenilor poartă markeri de diferite lungimi pe cromozomii materni și paterni. Astfel, în analiza LOH, locul pierderii alelelor poate fi determinat cu o precizie ridicată. Tehnicile recente utilizează detectarea bazată pe hibridizare a polimorfismelor SNP pentru a detecta diferențele genetice asociate cu LOH și alte modificări ale numărului de alele (63). Nagai și tsai. Analiza microsatelitelor de înaltă rezoluție a fost efectuată pe 120 de probe HCC de la pacienți asiatici și europeni, utilizând 195 de markeri polimorfi (67). Segmente de cromozomi cel mai frecvent afectate de LOH a

Numărul de cromozomi se modifică

În carcinoamele hepatocelulare, instabilitatea cromozomială duce la pierderi frecvente de alele și aneuploidie. Cele mai frecvent afectate gene sunt tumorile

absența sa în tumorile gastrointestinale are ca rezultat instabilitatea microsateliților. Cu toate acestea, în cazul HCC, aceste gene nu prezintă diferențe frecvente, exprimarea lor a fost menținută. Prin urmare, este probabil ca rolul lor în cancerul hepatic să fie mic (75).

Incidența amplificării (+) și a ștergerii (-) (%)