Cum se determină aflatoxinele?

Metode de testare

Există o serie de metode diferite pentru determinarea aflatoxinelor, dintre care cele mai multe sunt disponibile comercial.

Gama largă de opțiuni de testare ne permite să selectăm cea mai potrivită metodă de măsurare pentru condițiile date.

Pe baza complexității, fezabilității și a timpului necesar procedurilor, metodele sunt împărțite în două categorii principale: metode rapide, metode de referință.

Metode rapide

Metodele rapide sunt esențiale pentru rezultatele analitice disponibile într-un timp scurt.

Aceste proceduri permit efectuarea unor teste ușor de realizat la un cost mai mic, chiar și la locul de prelevare.

Dacă conținutul de micotoxine al unui lot trebuie confirmat printr-un test rapid, ca în cazul metodelor de referință, trebuie mai întâi să se asigure că proba este reprezentativă.

Compusul (compușii) testat (e) trebuie extras (i) înainte de a continua testul probei.

Pentru a determina rezultatele cantitative exacte, evaluarea trebuie efectuată cu un instrument de detectare.

În timp ce testele care dau rezultate calitative (da/nu) sau semicantitative (localizarea rezultatului în intervale specificate, de exemplu între 0,5 și 1 ppm) pot fi evaluate în mare parte vizual,.

Mai multe tehnologii diferite pot fi utilizate în metodele rapide dezvoltate pentru analiza aflatoxinelor.

Cele mai frecvente sunt testul imunosorbent legat de enzime (ELISA), banda test imunocromatografică (LFD) și metodele chimice.

Tehnica ELISA, care include metode de imunotestare, utilizează anticorpi specifici pentru componenta testată pentru a determina calitativ sau cantitativ micotoxinele din proba analitică.

Rezultatele sunt determinate de o reacție colorantă legată de enzime, în care intensitatea culorii este proporțională cu concentrația micotoxinei testate.

Testele ELISA în format competitiv sunt utilizate în mod obișnuit pentru a detecta micotoxinele, în consecință, intensitatea măsurată a culorii este invers proporțională cu concentrația componentei testate.

Aceste sisteme de testare ELISA oferă rezultate cantitative într-un timp scurt și sunt instrumente excelente de screening, care sunt adesea utilizate la locul de prelevare.

Cu toate acestea, reacțiile încrucișate cu molecule foarte similare substanței testate și efectele matricei observate în diferite produse pot afecta rezultatele testelor.

Cuantificarea tuturor aflatoxinelor, aflatoxinei B1, aflatoxinelor totale (B1, B2, G1 și G2), a aflatoxinei M1 poate fi efectuată de ELISA.

Producătorii testelor au luat în considerare diferitele praguri în diferite regiuni.

În consecință, pe baza cerințelor actuale care trebuie îndeplinite, fie că sunt valori limită locale sau praguri în vigoare în țara de destinație a exportului, pot fi selectate teste cu sensibilitate adecvată.

Atunci când se utilizează metode ELISA, se recomandă să verificați lista de matrice eșantion validate de producător cu acel kit.

Cu tehnica ELISA, o parte semnificativă a materiilor prime agricole poate fi testată conform instrucțiunilor producătorului, fără a utiliza pași speciali de curățare.

Cu toate acestea, testarea ELISA a tipurilor de probe mai complexe, cum ar fi furajele compuse, poate duce la rezultate inexacte.

Pentru a evita acest lucru, se recomandă consultarea producătorului testelor în lumina eșantionului specific de testat.

Benzile de testare imunocromatografice apar ca o altă tehnologie aplicabilă pe piața testelor rapide de micotoxină.

Metoda se bazează pe detectarea componentei testate prin cuplarea la un anticorp specific din zona de testare, care este situat pe membrana de pe banda de testare.

În plus față de zona de testare, a fost stabilită o zonă de control pe membrană pentru a verifica funcționarea corectă a testului.

Când extractul probei curge prin membrană, trece prin zonele de testare și control, în funcție de concentrația de toxină, fie ambele linii (de testare, cât și de control) vor fi vizibile sau doar linia de control.

Banda de testare poate fi evaluată cu ochiul liber, vizual sau cu ajutorul unui instrument de citire.

Dacă sunt necesare rezultate cantitative, evaluarea se realizează cu un instrument (fotometru de reflectanță) care măsoară intensitatea liniilor de testare și control și apoi evaluează rezultatele pe baza acestora.

Banda de testare imunocromatografică este o tehnică rapidă, ușor de realizat, ideală și rentabilă pentru testarea chiar și a unei singure probe și poate fi efectuată la locul de prelevare.

Ca și în cazul tehnicii ELISA, reacțiile încrucișate și efectele matricei în timpul testării produselor individuale limitează aplicabilitatea benzii de testare.

Benzi de testare imunocromatografice sunt disponibile atât sub formă calitativă, cât și cantitativă pentru determinarea aflatoxinelor.

Aceste teste au fost validate pe matrice eșantionale simple, adică utilizarea lor este recomandată pentru screeningul materiilor prime.

Cel mai frecvent exemplu de teste chimice utilizate pentru determinarea aflatoxinelor sunt sistemele de testare fluorimetrice.

După extracție, componentele care interferează cu testul trebuie eliminate din probă printr-o etapă de purificare și apoi proprietățile fluorescente ale substanței testate trebuie amplificate prin derivatizare.

Lumina emisă de analitul purificat la excitație este evaluată cu un fluorimetru.

Această tehnică este de obicei utilizată în studiul aflatoxinelor, deoarece acest grup de micotoxine are proprietăți fluorescente puternice, naturale.

Cu un astfel de test cuantificabil, cu costuri reduse, rezultatele pot fi obținute într-un timp scurt, chiar și pentru un eșantion.

Cu toate acestea, aplicarea metodei este limitată la componentele cu proprietăți fluorescente și unele produse prezintă efecte matriciale care pot afecta rezultatele analitice.

Testele fluorimetrice oferă o alternativă rapidă și fiabilă pentru determinarea tuturor aflatoxinelor (B1, B2, G1 și G2).

Metode de referință

Dacă se testează o matrice care, datorită complexității sale, nu se află pe lista substanțelor validate de producătorii testului sau dacă urmează să fie confirmat rezultatul unui test rapid, proba trebuie testată folosind metode de referință.

Metodele de referință pentru determinarea aflatoxinelor se bazează pe cromatografie, inclusiv cromatografie intensivă pe lichide (HPLC).

Diferența dintre metode se datorează tipului de detector utilizat după separare și, în cazul detectării fluorescente, metodei de derivatizare.

Sistemele cuplate HPLC-FLD și LC-MS/MS pot fi utilizate pentru determinarea aflatoxinelor.

Dacă se determină copmonenți separați folosind un detector fluorescent, este necesară derivatizarea post-coloană pentru a crește proprietățile fluorescente naturale ale aflatoxinei B1 și G1.

Această derivatizare poate fi realizată în mai multe moduri: electrochimic sau fotochimic.

Acidul trifluoroacetic sau bromura de K pot fi utilizate ca ingredient activ în derivatizarea electrochimică.

Cu toate acestea, substanțele chimice agresive care scurtează durata de viață a instrumentelor și capilarelor pot fi declanșate prin derivatizarea fotochimică.

Această din urmă metodă se bazează pe faptul că iradierea cu lumină UV la 254 nm crește proprietățile de fluorescență ale componentelor aflatoxinei B1 și G1 într-un mod echivalent cu derivatizarea electrochimică (Papadopoulou - Bouraoui și colab., 2002).

În cazul aflatoxinei M1 din lapte și produse lactate, nu este necesară nici o derivatizare, deoarece această componentă poate fi testată cu o sensibilitate suficientă prin ansamblul instrumentului HPLC-FLD.

Instrumentele HPLC se caracterizează prin sensibilitate ridicată.

Prin urmare, pentru rezultate bune, se recomandă purificarea extractului de probă înainte de injectarea pe coloana HPLC.

Purificarea poate fi efectuată cu o coloană de extracție în fază solidă (SPE) sau cu o coloană de imunoaffinitate.

În cazul coloanelor SPE, materialul de umplere a coloanei leagă orice substanță care interferează cu soluția eșantion și permite trecerea prin coloană a substanțelor relevante pentru test.

Eficiența de purificare depinde de interacțiunile solventului de extracție, matricea probei și umplutura coloanei.

Coloanele de purificare imună conțin anticorpi selectivi pentru micotoxinele de testat, care se află în gelul de pe coloană.

După ce extractul eșantionului este aplicat pe coloană, anticorpii leagă aflatoxinele din ea.

Ulterior, conform instrucțiunilor de aplicare ale producătorului, se recomandă spălarea coloanei cu, de exemplu, apă distilată pentru a îndepărta materialul nelegat.

După spălare, micotoxinele sunt dizolvate din gel, care conține în mod ideal doar micotoxinele legate, cu un solvent organic puternic (de exemplu 100% metanol).

Pentru a crește sensibilitatea metodei, se recomandă evaporarea solventului din eluat și apoi dizolvarea micotoxinei evaporate în faza mobilă HPLC înainte de injectarea acestuia.

Testele de referință includ utilizarea în creștere a sistemelor LC-MS/MS în analiza micotoxinei, care reprezintă cele mai avansate standarde analitice.

Există metode multitoxine care pot determina cantitatea de micotoxine reglementate legal (12 componente) într-o probă în 15 minute.

Răspândirea mai largă a acestor instrumente extrem de eficiente este împiedicată de costul bunurilor și personalului ridicat, adecvat pentru funcționarea profesională și dezvoltarea metodelor.

Prelevarea de probe

Orice metodă de testare este aleasă pentru măsurarea aflatoxinelor, unul dintre elementele cheie în determinarea micotoxinelor, prelevarea de probe, nu poate fi ignorat.

Eșantionarea este o procedură statistică în care o cantitate definită dintr-un eșantion este selectată dintr-un lot mai mare, astfel încât raportul și distribuția parametrului testat să fie aceleași atât în populație (lotul de control), cât și în eșantionul eliminat (eșantion).

Eșantionul este apoi supus testelor pentru a trage concluzii solide pentru populație pe baza rezultatelor sale.

Studiul micotoxinelor este un proces complex care constă în esență din trei părți:

luăm un număr de eșantioane mai mici din lot pentru a fi examinat la întâmplare și apoi le combinăm într-un singur „eșantion mare”
întregul lot este măcinat la o dimensiune fină a particulelor și o cantitate mică, „eșantionul analitic”, este prelevat prin sub-eșantionare reprezentativă
micotoxinele sunt extrase din proba analitică și cuantificate în cele din urmă

Recent, a fost observată dezvoltarea continuă a metodelor analitice pentru determinarea micotoxinelor.

Cu toate acestea, chiar dacă lucrăm cu o procedură de testare acceptată, trebuie să luăm în calcul faptul că fiecare dintre acești pași este supus variabilității.

Cercetările efectuate de un număr de oameni de știință confirmă faptul că eșantionarea este de obicei cea mai importantă sursă de eroare în studiul micotoxinelor.

De exemplu, aproape 90% din eroarea testelor aflatoxinei poate fi atribuită eșantionării.

Erorile semnificative de eșantionare la testarea micotoxinelor pot fi atribuite a doi factori principali: concentrația de micotoxine în produsele testate este foarte scăzută („problema ppb”) și distribuția lor nu este uniformă în loturile testate.

Deși nivelurile de micotoxină sunt excepțional de ridicate în unele boabe, concentrațiile globale de micotoxină într-un lot mai mare de cereale sunt, în general, foarte scăzute.

Unitatea de măsură utilizată în mod obișnuit este „părți pe miliard” (ppb - 1 parte pe miliard).

Cu toate acestea, nu putem ignora faptul că aflatoxinele au un efect asupra sănătății umane și animale chiar și la concentrații atât de scăzute.!

Spre deosebire de proteine sau umiditate, micotoxinele nu se găsesc în toate boabele.

În cazuri extreme, micotoxinele sunt prezente doar pe câteva boabe sau boabe pe un întreg câmp de cereale.

Aceasta înseamnă că, deși unele boabe au un nivel ridicat de toxine, alte boabe nu conțin deloc toxine.

Acest lucru se datorează faptului că matrițele nu cresc uniform pe câmpuri sau în depozitele de cereale.

Astfel, micotoxinele tind, de asemenea, să fie concentrate în puncte, numite puncte focale, în timp ce restul lotului este lipsit de toxine.

Cu toate acestea, cu cât este mai mare gradul de contaminare, cu atât este mai probabil să fie distribuit mai uniform.

În caz contrar, atunci când concentrația unei toxine într-un lot de cereale este scăzută, distribuția inegală este mai pronunțată.

În cazul unui test efectuat corect, se determină contaminarea medie a lotului inspectat.

Dacă nu se respectă procedura corectă de eșantionare, este probabil ca rezultatul testului să fie mai mic decât concentrația de micotoxină adevărată specifică lotului (de exemplu, dacă eșantionarea se face doar din zone fără toxine sau zone ușor contaminate) sau, dimpotrivă, mai mare (atunci când „din puncte focale ”luăm eșantionul).

Rezultatele fals negative sunt foarte frecvente în testarea micotoxinei, în mare parte datorită eșantionării inadecvate și pregătirii probelor.

Când se iau un număr mic de eșantioane incrementale sau eșantionul total incremental este prea mic, există o șansă mult mai mare ca boabele contaminate să fie „ratate” decât dacă sunt doar lovite și incluse în eșantionul testat.

Aceste tipuri de rezultate apar și atunci când întreaga probă de lot este subdivizată înainte de măcinare.

Rezultatele negative false sunt în mod normal de aproximativ 5%, dar pot ajunge până la 90%!

Pe de altă parte, rezultatele fals pozitive sunt mai mari decât valoarea reprezentativă.

Acest tip de rezultat este mai puțin frecvent decât un fals negativ.

Cu toate acestea, atât rezultatele fals negative, cât și rezultatele fals pozitive sunt dăunătoare, deoarece pot fi surse de pierderi economice semnificative.

Importanța eșantionării corecte devine evidentă atunci când considerăm că, de exemplu, o mașină de cale ferată are 55-80 t și o remorcă pentru camion este de cca. Conține 20 t de porumb și din care se examinează 20-50 g de probă măcinată, care trebuie să reflecte întregul lot.

Trebuie utilizate tehnici de eșantionare adecvate pentru a se asigura că eșantionul de testare este reprezentativ.

O probă prelevată din cel mai înalt strat de cereale transportat într-un vagon sau camion sau o probă de „găleată” prelevată în timpul descărcării mijloacelor de transport NU este reprezentativă pentru lotul inspectat și, prin urmare, nu este recomandată.

Prin eșantionarea doar a unei porțiuni din fluxul de cereale, eșantioanele pot influența, de asemenea, măsura în care eșantionul caracterizează lotul testat.

Prin urmare, prelevarea de lopată sau de mână nu este permisă în timpul testelor oficiale.

Distribuția componentelor, cum ar fi fracțiile sau materiile străine, este, în general, neuniformă pe toată sarcina.

Când bobul este golit într-un recipient (vagon, vagon sau siloz), ingredientele sunt separate în funcție de dimensiunea, densitatea și forma lor.

În timpul depozitării, particulele mai mici sunt concentrate în apropierea centrului, iar materialele și particulele mai mari migrează către exteriorul containerului.

Segmentarea inversă este observată la recuperare.

Aceste fenomene explică de ce aplicarea schemei de eșantionare corecte și a unui număr suficient de mare de eșantioane incrementale sunt esențiale pentru a se asigura că eșantionul are efectiv caracteristicile lotului inspectat.

În ceea ce privește micotoxinele, ne întâlnim adesea cu întrebarea „Care este cel mai bun mod de a testa această toxină sau alta?”

Mulți cred că putem obține rezultate exacte doar prin teste instrumentale de ultimă generație și de înaltă valoare.

Numai cea mai mare sensibilitate, selectivitate și cea mai mică limită de detecție pot fi suficient de bune.

Doar dacă acordăm atenția cuvenită eșantionării și o facem în mod responsabil, putem declara că tehnologia de testare costisitoare nu este o risipă de bani?!